1 siRNA设计
小干扰RNA（Small interfering RNA；siRNA）是一段长度在20-25个核苷酸之间的RNA双链。
其生物应用较多，目前主要用于干扰RNA，达到调节基因表达（敲减）的目的，其本质是siRNA和相应的mRNA特异性结合、降解，继而实现阻滞mRNA继续翻译的目的。
设计原则：
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siRNA序列不宜过长，超过30nt易导致其与其他mRNA非特异性结合，一般以19-25nt之间为宜。
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GC含量控制在35-55%之间，基因沉默效果最好。
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siRNA序列设计的靶序列一般为目的基因的CDS序列。
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一般siRNA需设计2-4条，另需要对照1-2条，序列设计完成后需要在BLAST中（BLAST: Basic Local Alignment Search Tool (nih.gov)进行比对，选择与靶基因特异性结合的序列进行合成即可。
上述原则是在设计siRNA时可以选择的一些参数，此外还有较为细节的原则如siRNA序列选择的位置、开始的碱基及序列及避免碱基单一等原则在使用三方网站设计时一般会自动规避。
siRNA合成后，一般是粉末状，根据说明书加入相应稀释液配置成相应浓度，配置完成后建议使用最小体积的Ep管分装（推荐5 μL分装一次）并于-80℃冰箱保存备用，避免反复冻融。
2 siRNA转染
转染步骤（采用Lipo8000™试剂）：
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转染前一天铺细胞，保证第二天转染前细胞密度可达70-80%。
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转染前准备Opti-MEM培养基、Lipo8000™试剂、siRNA及其他常见处理细胞的试剂、耗材。
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转染复合物配置如下表，按体积依次加入相应试剂并轻轻混匀，室温孵育20 min。
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复合物等待期间将培养基换成新鲜的完全培养基（六孔板-2mL）。
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20分钟后，将复合物加入到相应孔中，轻轻混匀后放入培养箱，禁止振荡混匀。
注意事项：
转染步骤（Lipofectamine ™ RNAiMAX转染试剂）：
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转染前准备试剂包括：Opti-MEM培养基、Lipofectamine™ RNAiMAX试剂、siRNA、不加双抗的10%FBS培养基、胰酶、PBS缓冲液等常见处理细胞的试剂。
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细胞密度≥90%。
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按正常处理细胞的流程将长满的细胞经过胰酶消化离心后去上清，注意此处需要加无双抗的10%FBS培养基1 mL进行细胞重悬，重悬完后根据细胞生长速度铺细胞，保证转染完后24 h细胞密度达到30-50%。
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转染复合物制备：根据说明书制备转染复合物，添加量如下表所示。根据转染的实际用量将Opti-MEM培养基、Lipofectamine™ RNAiMAX试剂、siRNA依次加入到一个无菌Ep管中，按照先加Opti-MEM培养基、再加siRNA最后加Lipofectamine™ RNAiMAX试剂的顺序，轻轻混匀室温孵育20 min
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20 min后依次将转染复合物加入细胞培养皿中，轻轻混匀，放入细胞培养箱内。
注意事项：
3 siRNA转染效率验证
siRNA转染后一定时间内，需采用基本方法验证其转染效率，常见验证方式包括Western blot、RT-PCR、流式细胞术及ELISA等，对于含有荧光的质粒，也可采用荧光显微镜直接观察的方式来大致确定转染效率。
一般来说，由于转染后的细胞常用于功能学实验，因此应该选用可以确定其转染效率的方法，本文主要分享在mRNA水平或蛋白水平上验证基因沉默的效果。
收细胞时间由转染方式及细胞状态来决定，一般至少为转染后48 h，上限一般为3-5天。
mRNA水平验证
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提取转染后的细胞的RNA并逆转录获取相应的cDNA后，配制SYBR、RNase-free water和cDNA的混合液，按照SYBR：RNase-free water为3：4的比例配制，cDNA按照一个孔（八连管）0.25 μL配制。
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引物配制：按照每孔上下游引物的混合物为1μL配制混合液。
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将上述混合物离心并混匀，依次加入到八连管中，第一步中混合液每孔贴上壁加7 μL,第二步中混合液每孔加1μL，并注意将目的引物与内参引物区分，避免上样时出错。
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将八连管离心—震荡—再离心，使得引物与底物充分混匀，将离心好的八连管放至PCR仪，启动Bio-Rad CFX Manager程序。
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RT-PCR结束后，保存曲线备用，并分析相应结果，绘制相应mRNA表达水平图比较转染效率，也可使用转染效率（%）=（1-2^-△△CT)*100%直接计算。
注意事项：
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实验过程中必须戴口罩、手套，尽量避免其他人员干扰。
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RT试剂盒从冰箱拿出，应该充分解冻，瞬离后混匀，放于冰上，可在冰上加样，避免反复冻融。试剂可以用数字贴纸编号，避免漏加、错加试剂。
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取用不同的试剂时，必须更换枪头，样本之间要避免交叉污染。
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反应体系配好之后，应充分混匀，瞬离，并且弹去管内的气泡。
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每个样品至少3个平行孔，所有成分加完后，离心去除气泡。
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如果目的基因表达量非常低，最多加入1 μg Total RNA，否则加入RNA量过高，可能会超出后续PCR的线性范围。
蛋白水平验证
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收集转染后的细胞提取蛋白并根据目的分子量大小选择配制适宜浓度的胶。
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将变性后的蛋白液先震荡，再离心，可根据BCA测定的蛋白浓度上样；
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根据日常经验进行电泳、转膜、封闭、敷抗体即可。
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曝光条带保存备用，使用Image J计算灰度值，绘制蛋白水平图，分析转染效率。
注意事项：
4 siRNA转染效率验证注意事项
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对于转染后的细胞，由于转染试剂毒性或敲减某基因可造成细胞状态不好或细胞数量较低，不管提蛋白或RNA，都应小心操作，避免细胞太少。
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转染48h后可根据转染方式进行换液等操作，一般而言，对于敲减的细胞细胞一般会出现细胞变圆、细胞漂起来等现象，因此在选择收细胞天数时应多加注意，防止细胞死光，我个人而言，使用Lipofectamine RNAiMAX Reag转染最多可维持5-6天。
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由于最终生物功能还是由蛋白决定，因此最终确定转染效率一般均需进行Western blot。
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