这种情况答案可能不是抗体不行，也不是曝光不够，而是——你的蛋白样本，在上样前就已经“阵亡”了。
WB样本降解如何体现在实验结果中
1 首先，蛋白质定量看不出来
已经发生降解的蛋白质样本，在上样前做蛋白质定量时通常没有明显表现。
无论是BCA法还是Bradford法，它们都是通过氨基酸残基的反应来测定总蛋白含量。一个50kDa的蛋白降解成三段，它的氨基酸残基仅仅只是分散了而不是消失了，所以测出的总蛋白浓度几乎仍然是准确的。
也就是我们并不能在这一步看出样本是否发生降解。
2 其次，条带才会告诉你真相
所以直到上样跑胶出结果，我们才能看到样本降解的最直观的体现：你期待的那条清晰主带消失了，取而代之的是一堆杂乱的小分子量条带。
最重要的是所有出现问题的条带都是往下偏移的，也就是说所有的问题条带分子量都变小了。这基本就是降解的典型信号。这个情况就不要怀疑抗体特异性不强了，这个真是冤枉的。
但是非常遗憾的是，样本降解了在后续没有补救方法，我们只能选择重新制备样本再奋斗一次。所以接下来我们来讲讲制备样本时避免蛋白降解的操作要点
避免降解的操作要点
样品中的蛋白酶和磷酸酶会快速降解蛋白。这就是裂解时为什么要加酶抑制剂。防止蛋白降解，核心就两个字：保鲜。而保鲜的关键，就是全程低温、快速操作。
1 提好蛋白尽快实验
出去吃饭很多店都说现杀活鱼对吧，因为杀久了蛋白质会降解，那味儿就不对了。提蛋白也是一样，细胞也讲究一个现杀活细胞现提蛋白质、现上样做实验。
所以做WB实验最好是提好蛋白后立即加入上样缓冲液（loading buffer），煮样后马上电泳。不要想着今天我有空一次裂解一大批，冻着当预制菜下次拿出来热热再用。
如果非得存着下次用不可，裂解时确保加入蛋白酶抑制剂，如果研究磷酸化蛋白，还要加入磷酸酶抑制剂。裂解后，-80°C速冻分装保存，之后做实验要多少拿多少，避免反复冻融。
2 低温，冰上操作
从细胞裂解开始，就应该把EP管、培养皿放在冰上。尽量降低环境温度，从而减缓蛋白酶和磷酸酶的活性。
即便是超声裂解，也要用冰给样本保持低温。所以别嫌麻烦，哪怕只是转移样本，也要一直用冰盒装。
3 加入蛋白酶与磷酸酶抑制剂
无论你用的是RIPA还是别的裂解液，一定要加入新鲜的蛋白酶和磷酸酶抑制剂。抑制剂是消耗品，不是加一次就一劳永逸的。如果样本存放时间较长，再次使用时可能还要再加点。
总结一下，防止WB样本降解：冰上操作，延缓降解；现提现用，避免久放；正确加入蛋白酶抑制剂。
记住，再好的抗体也救不回已经降解的蛋白。从样本制备的第一步就开始保鲜，你的WB结果才会更清晰、更可靠。
