空斑测定仍然是通过在细胞培养中计数离散斑点（感染单位和细胞死亡区）来直接定量感染性病毒颗粒和抗病毒物质的最准确方法之一。通常使用固态或半固态覆盖基质，如琼脂糖或羧甲基纤维素，以限制病毒传播，防止病毒通过液体培养基的无差别感染。固定覆盖层将细胞感染限制在周围的单层细胞，从而允许形成可计数的离散感染灶和随后的斑块形成。

        在初次感染和施加固定覆盖层之后，单个斑块或细胞死亡区将开始形成，因为病毒感染和复制被限制在周围的单层细胞中。被感染的细胞将继续进行复制-裂解-感染循环，进一步传播感染，导致斑块越来越明显且独立。根据病毒的生长动力学和所使用的宿主细胞，通常在2到14天内可以形成可见的斑块。然后可以使用标准明场显微镜计数细胞单层，或者更常见的方法是通过中性红或结晶紫进行固定和复染，以便肉眼轻松识别斑块。有多种斑块复染剂可供选择，每种都有其特定的优点和缺点。

         今天给就给大家介绍了四种常用的空斑染色液：

（1）结晶紫

       结晶紫是一种碱性染料，能够与细胞核中的DNA结合，使细胞核染成深紫色，常用于观察细胞形态。

        在空斑实验中，中性红和结晶紫都可以用来显示病毒引起的细胞病变区域，但结晶紫染色后的空斑通常更加清晰，且结果可以长期保存，这也是为什么结晶紫用的最广泛的原因。结晶紫通常在收获时添加，并在覆盖物固定/去除后使用，提供快速且明显的复染，使在存在混合形态时能够识别非常小的斑点。

（2）中性红

      中性红是弱碱性pH指示剂（变色范围pH 6.4–8.0），可通过非离子扩散进入活细胞，在酸性溶酶体中积累呈红色；死细胞无法维持pH梯度，不被染色。在病毒空斑实验中，活细胞被染成红色背景，病毒感染导致的细胞死亡区域（空斑）呈无色透明斑点，便于计数和滴度计算。中性红染色法广泛用于流感病毒、呼吸道合胞病毒等CPE阳性病毒的定量。

       中性红的优点在于可早期应用并与覆盖物保持持续接触，从而可以实时监测斑点的形成，这在处理未知病毒或复制动力学时尤其有用。中性红的缺点是有时染色结果并不十分明显。

（3）MTT

      MTT（噻唑蓝）通过线粒体脱氢酶作用被活细胞还原为深蓝色的甲臜结晶，而死细胞无此反应。MTT染色的浓度可以是0.5mg/ml。通过染色后观察未染色区域（空斑），即可确定病毒感染区域。

MTT的优点是可以替代中性红，减少细胞毒性。病毒空斑呈深蓝色，与正常细胞的白色对比明显，易于观察计数。且可以在病毒感染早期进行染色观察。

      MTT的缺点是需要在染色后避光培养，否则染料分解对细胞具有毒性作用。另一个缺点是MTT染色后需要培养4小时，从而允许细胞吸收染料，因此较其他染料耗时长。

（4）考马斯亮蓝

       考马斯亮蓝是一种阴离子染料， 常用  考马斯亮蓝有G250  和R250。考马斯亮蓝 G250在游离状态下呈红色，当它与蛋白质 通过疏水结合后变为蓝色。