1 qPCR基本概念

1-1 qPCR是什么

实时荧光定量聚合酶链式反应（Quantitative Polymerase Chain Reaction）简称qPCR，它通过在PCR（DNA扩增）反应中添加荧光基团达到检测每次PCR循环后产物总量的目的，从而进行定量分析。

其中荧光通常分为荧光染料和荧光探针；通过实时荧光定量PCR仪每一次PCR循环结束后均可以实时监测并收集荧光信息；通过荧光强度和CT或者Cq值信息，获取定量的结果。

qPCR技术具有精准、高效的特点，是医学、生物学、农业等领域至关重要的研究工具。

1-2 应用领域

qPCR在分子生物学研究中被广泛应用于基因表达水平分析例如细胞、组织、血清、血浆等不同生物样本差异基因的表达水平分析，可适用于疾病的快速筛查和早期诊断。

在临床检验中用于病原体检测和定量，例如病毒核酸载量检测、区分基因型别以及突变株鉴定等。

另外，在食品、环境微生物检测中也具有广泛应用，例如食品转基因鉴定、致病菌检测以及菌种的分离鉴定等。

1-3 与传统PCR的区别

（1）PCR是实现DNA扩增的一种反应。该反应由高温变性、低温退火及适温延伸等步骤组成一个循环周期；其中每完成一个循环，DNA总量增加1倍，根据设置的循环数使得模板DNA的拷贝数呈指数快速增加。

2 qPCR的核心原理

根据实时荧光定量PCR所使用荧光不同，qPCR分为荧光染料和荧光探针法。

2-1 染色法（SYBR Green I）

2-1-1 基本原理

SYBR Green I荧光染料被广泛应用于各种分子生物学实验研究。SYBR Green I是一种能与DNA双链结合的荧光染料，染料本身荧光微弱；但结合到DNA双链上的SYBR染料能够发射荧光信号，而没有结合的不会发射。

另外，在PCR扩增中，随着DNA产物增加，荧光信号同步增强，实时荧光定量PCR仪通过监测荧光强度变化可以反映产物量从而达到定量的目的。

2-2-3 主要应用领域

（1）分子实验的快速验证：通过分析qPCR的融解曲线判断是否存在引物二聚体、非特异性扩增产物，特异性验证PCR产物；或者优化引物的特异性；实验预算有限的大量基因表达分析。

（2）基础研究中的基因表达分析：前期大量差异基因的筛选和初步验证，例如对高通量测序的结果进行初步筛选，对多个差异基因的表达量快速检测。

（3）基因分型：结合qPCR的融解曲线，扩增产物的Tm值差异可反映不同基因型。

2-2 探针法（TaqMan探针法）

2-3-1 基本原理

（1）区别于染料法的是，探针法在PCR反应体系中需要加入除了引物之外的特异性探针。其中TaqMan探针是具有荧光基团标记的常用水解探针，通常会在5’端携带荧光报告基团，3’端携带荧光淬灭基团；该探针能够与目的DNA片段特异性杂交，在PCR延伸阶段可对扩增产物进行定量。

主要原理是，当TaqMan探针能与目的DNA片段特异性杂交，探针的荧光报告基团会因为荧光淬灭基团的存在而不会产生荧光信号；但是在PCR扩增阶段，反应体系中的Taq DNA聚合酶具有5’—3’的外切酶活性可水解与模板DNA结合TaqMan探针，此时荧光报告基团和荧光淬灭基团分开，从而产生荧光信号并被收集。

随着反应设置的循环周期不断进行，PCR扩增产物不断增加，水解的TaqMan探针的量也逐渐增多。因此荧光信号强度与PCR产物的生成量呈正比。

（2）除了常用的TaqMan水解探针，还存在分子信标、双杂交探针的等杂交探针。类似地，分子信标是一种“发卡”即茎环结构的单链DNA探针，两端分别也标记荧光报告基团和荧光淬灭基团。

在正常情况下探针呈茎环结构，荧光报告基团与淬灭基团靠近，荧光被淬灭；而在PCR延伸过程中，与扩增产物杂交结合的发卡结构被逐渐打开，荧光报告基团与淬灭基团分离，发出荧光信号进而被收集。

2-3-3 主要应用领域

（1）在临床诊断中，用于严格区分病毒的变异株即对比目标序列与同源序列，探针法能够确保结果的准确性。

（2）可为靶向治疗提供依据，通过探针法严格检测肿瘤基因突变的拷贝数，对肿瘤标志物基因进行精准定量。

（3）可对复杂样本进行分析，例如样本本身存在大量同源序列干扰，可通过探针的高特异性排除非目的扩增。

（4）进行多重PCR检测，例如可通过标记不同荧光基团的探针，同时检测多个基因或者多种病毒的表达。

（5）可对特定物种基因进行检测或食品转基因成分的精准定量。

3 qPCR的关键参数与分析指标

3-1 扩增曲线

在qPCR程序中，扩增曲线是以PCR的循环数（Cycles）、荧光信号强度（RFU）分别为横坐标、纵坐标进行绘制得到的曲线，其中扩增曲线分为基线期、对数期以及平台期

3-2 CT值（循环阈值）

循环阈值（CT/Cq值）如图3-1所示，CT/Cq值是指当荧光信号强度达到软件默认设置的荧光阈值所对应的PCR Cycles数值。

通常地，CT/Cq值与模板cDNA的量呈负相关，即当提取DNA浓度越大相应获取的越多模板cDNA时，达到阈值所需要的循环数就越少，则CT/Cq值越小；相反，CT/Cq值越大。

通常模板cDNA的量很小，达到阈值所需要的循环数大于35以上认为CT/Cq值没有意义；另外 ，在实验条件一样的相同模板即重复孔CT/Cq值的差异一般小于或等于0.5个循环，否则认为存在较大实验误差。

3-3 标准曲线

标准曲线通常被用于评估PCR扩增效率。通常地，将已知浓度的质粒DNA标准品梯度稀释成不同浓度用于进行qPCR程序获取Cq值（或称为CT值），然后根据各梯度浓度与相应的Cq值用Excel绘制标准曲线，并获取线性方程Cq=-k×lg C+b（k＞0，C为质粒DNA标准品或cDNA的初始模板浓度）。在实际情况中，购买使用的荧光定量试剂一般会附有标准曲线。

3-4 扩增效率

qPCR的扩增效率是指每个PCR循环中模板cDNA的扩增倍数，一般通过标准曲线的线性方程来确定，扩增效率（E）=10^{（-1/斜率k）}-1，实际情况中要求扩增效率范围在90%-110%。

认为扩增效率比较理想。当存在引物二聚体、退火温度设置不当等情况，会降低扩增效率；另外引物特异性不好可能导致非特异性扩增出现扩增效率过高。

3-5 融解曲线

qPCR融解曲线是PCR扩增阶段结束后对扩增产物进行特异性分析的关键质控步骤，通常用于判断扩增产物是否单一、特异。因此，在PCR扩增结束后，当温度逐渐升高至95℃，荧光信号随温度变化的曲线即为融解曲线。

4 注意事项

• qPCR引物设计时，需要注意引物的特异性；一般引物特异性较好时，溶解曲线为单峰，这可通过NCBI网站Primer BLAST进行验证。

• qPCR程序设置严格按照所使用荧光定量试剂盒程序进行设置，注意循环周期、退火温度（60℃）的设置。

• 保证逆转录模板cDNA有效性；提取RNA时需注意防止RNA降解，控制RNA质量0D260/OD280（2.0-2.2）。

• 模板浓度过高时需稀释模板后使用，因为模板过量可能会导致CT过小，定量不准；一般调整模板量使目标基因CT/Cq值在15~30之间。

• qPCR点样时设置对照组、重复孔等，可通过计算、预混合无核酶水、引物、模板后加样减小误差。

• 上机之前按压八连排盖子听到“咔哒”声保证密封条贴紧；接着需用掌上离心机瞬时离心混匀，将反应体系完全离心至管底。

• 注意对八连排进行标记编序，防止离心打乱加样顺序。

• SYBR Green I染料使用时需注意避光，体系配置完成后续需尽快上机。

• 移液时注意缓慢滴加各组成分，避免产生气泡干扰荧光检测。

• 保证反应体积、体系一致，体系包括正、反引物、模板cDNA、SYBR Green I/TaqMan探针、ddH₂O，反应体积一般为20μL或者10μL。

• qPCR程序设置时需注意勾选相应的检测方法，选择SYBR或者FAM等。

• 循环参数设注意选择两步法或者三步法，根据购买的荧光定量试剂进行确定。

• 注意编辑“Plate Set up”时，清晰标注样本名称包括对照组、实验组、重复孔、内参基因名称、目的基因名称。

• 保证数据较好的重复性，若重复孔CT/Cq值相差过大（大于0.5）则统计结果不可信。