1 实验原理

人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，HUVEC），是从脐带静脉中分离出来的原代细胞。这种细胞是研究内皮细胞的模型系统，研究相关的低氧、炎症、氧化应激、感染反应以及正常和肿瘤相关血管生成等应用。

2 实验材料

• 耗材：T25培养瓶、无菌离心管、移液管、冻存管、吸头

• 试剂：完全培养基及补体成分、0.05% 胰酶-EDTA、FBS、PBS缓冲液、DMSO

• 设备：水浴锅、超净台或生物安全柜、离心机、培养箱、显微镜

 

2. 操作步骤

(1) 弃培养基：吸净旧培养基，用37℃预热的 PBS 轻轻洗涤 3 次（去除血清和代谢废物）。

(2) 消化细胞：加入适量 0.05% 胰酶 - EDTA（覆盖瓶底即可），37℃孵育 1~2 分钟，显微镜下观察至细胞变圆、少量脱落（注：避免消化过度，HUVEC 对胰酶敏感，超过 3 分钟易损伤细胞膜；若细胞难消化，可改用 含 0.25% 胰酶 + 0.02% EDTA 的消化液，并缩短时间。）

(3) 终止消化：立即加入等量含血清的培养基（血清中的蛋白酶抑制剂可中和胰酶），用移液管轻柔吹打瓶底，使细胞完全脱落（吹打时避免产生气泡，减少机械损伤）。

(4) 离心收集：将细胞悬液转移至离心管，120×g 离心 5 分钟，弃上清。

(5) 分瓶培养：用新鲜培养基重悬细胞，按 1:2~1:3 比例传代（原代细胞建议 1:2，传代后密度不低于 5×10³ cells/cm²）。轻轻混匀后接种至新的包被培养瓶，补加培养基至合适体积（如 T25 瓶加 5 mL）。

3. 注意事项：

• 吹打技巧：使用宽口移液管（或剪去枪头尖端），沿瓶壁缓慢吹打，避免垂直吹打导致细胞损伤。

• 传代密度：密度过低会导致细胞凋亡，可添加 10 ng/mL VEGF 促进低密度下的存活。

 

3.3 细胞冻存

1. 冻存时机：选取 对数生长期细胞（汇合度 70%左右，状态健康、无污染），避免使用老化或高代次细胞（>10 代）。

2. 冻存液配制

• 经典配方：90% FBS + 10% DMSO（适合短期保存）。

• 优化配方：55% 基础培养基 + 40% FBS + 5% DMSO（减少血清用量，适用于珍贵细胞）。

• 注意：DMSO 需选用细胞级（无热源），提前预冷至 4℃（DMSO 是最常用的冷冻保护剂，但其毒性随温度升高而增加）。

3. 操作步骤

(1) 消化收集细胞：按传代步骤消化细胞，离心后用 PBS 洗 1 次（去除血清中的杂质）。

(2) 调整密度：用冻存液重悬细胞，调整浓度至 5×10⁶ cells/mL左右（密度过低易冻死，过高易结块）。

(3) 分装与标记：将细胞悬液分装至冻存管，标记细胞名称、代次、冻存日期及操作者信息。

(4) 梯度冻存：4℃放置 30 分钟 → -20℃放置 1 小时 → -80℃过夜 → 转入液氮罐长期保存（或使用程序降温盒直接放入 - 80℃）。

4. 注意事项

• 冻存管检查：使用前确认冻存管密封性，避免液氮渗入导致复苏时爆炸。

• 复苏验证：冻存后随机抽取一管复苏，检测细胞存活率（台盼蓝染色应 > 90%）。

 

 

4 日常维护

1. 培养基更换

• 原代细胞：隔天换液（培养 48 小时后首次换液，之后每 2 天一次）。

• 传代细胞：根据密度调整，通常每 2 天换液，若培养基变黄（pH 下降）需及时更换。

• 操作：轻轻吸净旧培养基，沿瓶壁缓慢加入预热的新鲜培养基（避免冲散细胞）。

 

2. 显微镜每日观察

• 形态：正常 HUVEC 呈铺路石样或短梭形，边界清晰，无空泡或多核。

• 密度：避免超过 90% 汇合度，及时传代防止老化。

• 污染：观察培养基是否浑浊、有无漂浮物（细菌污染）或丝状物（真菌污染），发现污染立即丢弃。

3 实验步骤

3.1 细胞复苏

1. 准备工作：

• 预配型完全培养基：EGM-2（内皮细胞生长培养基 - 2） ，含基础培养基及补体成分。

• 使用方式：将基础培养基和补体成分混合后使用，最终血清浓度为2%（低血清培养可避免血清诱导的异常分化，保留细胞特异性标志物表达，也可根据具体实验需求调整血清浓度，选择无血清的培养基）

• 注：补体成分含人成纤维细胞生长因子（hFGF-B）、血管内皮生长因子（VEGF）、人表皮生长因子（hEGF）、胰岛素样生长因子（IGF-1）胎牛血清（FBS，最终浓度 2%）、氢化可的松、抗坏血酸等辅助成分、双抗（青霉素 / 链霉素）。

• 提前预热培养基至 37℃，准备好无菌离心管、移液管。T25培养瓶用 0.1% 明胶或 1% 胶原包被（37℃孵育 30 分钟，使用前弃去包被液，用 PBS 洗 1 次）。

2. 解冻细胞：从液氮中取出冻存管，立即放入 37℃水浴（水面没过冻存管，但避免进水污染），轻轻晃动至完全融化（<1 分钟，避免冰晶形成损伤细胞）。

3. 清洗细胞：用 75% 酒精消毒冻存管表面，将细胞悬液转移至 15 mL 离心管，缓慢加入 5 mL 预温培养基，轻轻吹打混匀（稀释 DMSO 浓度）。120×g 离心 5 分钟，弃上清，避免残留 DMSO 抑制细胞活性。

4. 接种培养：用新鲜培养基重悬细胞，按 1×10⁴~2×10⁴ cells/cm² 接种至包被好的T25培养瓶，轻轻晃动使细胞均匀分布。放入 37℃、5% CO₂培养箱，24 小时后更换培养基（去除未贴壁细胞和死细胞）。

5. 注意事项

• 避免反复冻融：冻存管取出后需立即解冻，若一次未用完需丢弃，不可二次冻存。
  

• 包被必要性：HUVEC 贴壁依赖细胞外基质，未包被会导致贴壁率低（尤其原代细胞）。

3.2 细胞传代

1. 传代时机

细胞汇合度达 80%~90%（铺路石样铺满瓶底，未出现重叠或管腔样结构），过度汇合会加速细胞老化。

2. 操作步骤

(1) 弃培养基：吸净旧培养基，用37℃预热的 PBS 轻轻洗涤 3 次（去除血清和代谢废物）。

(2) 消化细胞：加入适量 0.05% 胰酶 - EDTA（覆盖瓶底即可），37℃孵育 1~2 分钟，显微镜下观察至细胞变圆、少量脱落（注：避免消化过度，HUVEC 对胰酶敏感，超过 3 分钟易损伤细胞膜；若细胞难消化，可改用 含 0.25% 胰酶 + 0.02% EDTA 的消化液，并缩短时间。）

(3) 终止消化：立即加入等量含血清的培养基（血清中的蛋白酶抑制剂可中和胰酶），用移液管轻柔吹打瓶底，使细胞完全脱落（吹打时避免产生气泡，减少机械损伤）。

(4) 离心收集：将细胞悬液转移至离心管，120×g 离心 5 分钟，弃上清。

(5) 分瓶培养：用新鲜培养基重悬细胞，按 1:2~1:3 比例传代（原代细胞建议 1:2，传代后密度不低于 5×10³ cells/cm²）。轻轻混匀后接种至新的包被培养瓶，补加培养基至合适体积（如 T25 瓶加 5 mL）。

3. 注意事项：

• 吹打技巧：使用宽口移液管（或剪去枪头尖端），沿瓶壁缓慢吹打，避免垂直吹打导致细胞损伤。

• 传代密度：密度过低会导致细胞凋亡，可添加 10 ng/mL VEGF 促进低密度下的存活。

3.3 细胞冻存

1. 冻存时机：选取 对数生长期细胞（汇合度 70%左右，状态健康、无污染），避免使用老化或高代次细胞（>10 代）。

2. 冻存液配制

• 经典配方：90% FBS + 10% DMSO（适合短期保存）。

• 优化配方：55% 基础培养基 + 40% FBS + 5% DMSO（减少血清用量，适用于珍贵细胞）。

• 注意：DMSO 需选用细胞级（无热源），提前预冷至 4℃（DMSO 是最常用的冷冻保护剂，但其毒性随温度升高而增加）。

3. 操作步骤

(1) 消化收集细胞：按传代步骤消化细胞，离心后用 PBS 洗 1 次（去除血清中的杂质）。

(2) 调整密度：用冻存液重悬细胞，调整浓度至 5×10⁶ cells/mL左右（密度过低易冻死，过高易结块）。

(3) 分装与标记：将细胞悬液分装至冻存管，标记细胞名称、代次、冻存日期及操作者信息。

(4) 梯度冻存：4℃放置 30 分钟 → -20℃放置 1 小时 → -80℃过夜 → 转入液氮罐长期保存（或使用程序降温盒直接放入 - 80℃）。

4. 注意事项

• 冻存管检查：使用前确认冻存管密封性，避免液氮渗入导致复苏时爆炸。

• 复苏验证：冻存后随机抽取一管复苏，检测细胞存活率（台盼蓝染色应 > 90%）。

4 日常维护

1. 培养基更换

• 原代细胞：隔天换液（培养 48 小时后首次换液，之后每 2 天一次）。

• 传代细胞：根据密度调整，通常每 2 天换液，若培养基变黄（pH 下降）需及时更换。

• 操作：轻轻吸净旧培养基，沿瓶壁缓慢加入预热的新鲜培养基（避免冲散细胞）。

2. 显微镜每日观察

• 形态：正常 HUVEC 呈铺路石样或短梭形，边界清晰，无空泡或多核。

• 密度：避免超过 90% 汇合度，及时传代防止老化。

• 污染：观察培养基是否浑浊、有无漂浮物（细菌污染）或丝状物（真菌污染），发现污染立即丢弃。