细胞培养作为生物学研究的基础技术，在生命科学领域应用广泛。无论是疾病机制探究、药物研发，还是细胞治疗研究，都离不开健康、稳定的细胞培养。但不少小伙伴在养细胞时，总会遇到各种问题，细胞状态不佳，生长缓慢甚至死亡，让人头疼不已。今天，咱们就来盘点一下细胞总是养不好的常见原因，帮大家 “对症下药”，成功 “养好细胞”。

一、细胞自身状态不佳

1.1 传代次数过多

随着传代次数增加，细胞会逐渐老化，其分裂能力、代谢活性等都会下降。比如一些细胞系，传代超过一定次数后，形态会发生改变，原本饱满圆润的细胞变得扁平、皱缩，生长速度也明显减缓。建议在细胞培养过程中，密切记录细胞传代次数，当细胞传代达到一定代数，出现老化迹象时，及时复苏新的低代次细胞。同时，尽量避免细胞过度生长，在细胞处于对数生长期时进行传代，可保持细胞良好状态。

1.2 细胞接种量不当

接种量过低，细胞在培养体系中 “势单力薄”，分泌的生长因子等物质有限，相互之间的信号交流不足，导致生长缓慢。相反，接种量过高，细胞过于拥挤，营养物质消耗过快，代谢废物堆积，也会影响细胞生长。不同细胞类型有其适宜的接种密度，一般在细胞培养手册或相关文献中会有推荐。例如，某些贴壁细胞的接种密度可能为每平方厘米 1×10⁴ - 5×10⁴个细胞，悬浮细胞则可能是每毫升 1×10⁵ - 5×10⁵个细胞。在接种细胞前，一定要根据细胞特性，准确计算并调整好接种量。

1.3 传代时间过晚

细胞生长是有规律的，当细胞长满培养瓶底，达到融合状态后，如果不及时传代，细胞就会进入生长抑制期，甚至开始死亡。这是因为细胞密度过高，营养物质供应不足，代谢废物大量积累，还可能引发细胞之间的接触抑制，影响细胞正常生理功能。要养成定期观察细胞状态的习惯，一般当细胞汇合度达到 80% - 90% 时，就应及时进行传代操作，为细胞提供充足的生长空间和营养。

1.4 胰酶消化不当

胰酶消化是细胞传代过程中的关键步骤。消化时间过长，胰酶会过度损伤细胞膜及细胞内部结构，导致细胞死亡；消化时间过短，细胞无法从培养瓶底完全分离，吹打时容易成团，这些细胞团内的细胞由于营养摄取和气体交换受限，也会逐渐死亡。不同细胞对胰酶的敏感性不同，消化时间也有差异。比如一些贴壁较松的细胞，可能消化 1-2分钟即可，而贴壁较紧的细胞，可能需要 3-5分钟甚至更长时间。在消化细胞时，要在显微镜下密切观察细胞状态，当细胞开始变圆、间隙增大，轻轻晃动培养瓶，细胞呈流沙状脱落时，立即终止消化。

1.5 冻存与复苏问题

细胞冻存和复苏过程操作不当，也会对细胞造成严重损伤。冻存时，如果降温速度过快，细胞内水分会迅速结晶，冰晶会刺破细胞膜和细胞器，导致细胞死亡；复苏时，如果解冻速度过慢，细胞会在较高温度下停留时间过长，同样会受到损伤。正确的冻存方法是采用梯度降温，可先将细胞放入 - 20℃冰箱 2 小时，再转移至 - 80℃冰箱过夜，最后放入液氮中长期保存。复苏时，应将冻存管迅速放入 37℃水浴中，轻轻晃动，使其在 1 - 2 分钟内快速解冻。