首先是磁珠分离法。磁珠分离法的分选策略有阳性分选策略、阴性分选策略和复合分选策略。可依据细胞不同的状态采用不同的方法。如果目的细胞是一群未知的群体，可用阴性分选方法去除已知的非目的细胞，剩下末受影响的目的群体做研究实验。假如细胞表面的标志比较弱可用复合分选的方法，如CD4⁺、CD25⁺T细胞先用CD4⁺T细胞阴性筛选试剂盒分离外周血淋巴细胞，再用CD25⁺的阳性分离法分选出CD4⁺、CD25⁺T细胞。由于磁珠分选方法使用的仪器小巧，消毒方便，不需要专人操作，实验流程对细胞损伤小，有极好的回收率和存活率，因此，正普遍被人接受作为分选细胞的有效方法。    其次是流式细胞术分离法。流式细胞仪快速有效地分选出肿瘤特异性CD4⁺、CD8⁺T细胞株。经测定，这种分离方法并不改变肿瘤特异性T细胞功能和表型。此方法是通过细胞表面的特异性标志不同而辨别细胞亚群。但是流式细胞术分离T细胞的效率与仪器的操作者处理数据的能力相关。流式细胞仪及其抗体都较昂贵，有些实验室的仪器条件也不允许，则限制了其在一般实验室的广泛应用。具体操作如下：

磁珠分离法操作步骤（以小鼠为例） 

1.用5只小鼠的淋巴结或2只小鼠的脾脏制备单细胞悬液并去除红细胞(单元2.1)。

2.将细胞在10ml HBSS洗涤缓冲液中混悬后用血细胞计数器计数(附录3A)。

3.将细胞悬液在4℃，200g离心10min。弃上清后将沉淀在MACS缓冲液中混悬。加入0.1ml适当的磁珠(表2.2.1)后在4℃孵育 15min。

4.在孵育的时间里，打开autoMACS系统电源。按产品说明书中操作规程运行清洁程序。

5.将细胞悬液在4℃，200g离心10min。弃上清，在沉淀中加入足量的MACS缓冲液使细胞浓度达到10^8个细胞/ml，充分混悬。将细胞通过30μm尼龙网或40μm预分离滤膜。用0.1~0.4mlMACS缓冲液冲洗滤网。

6.将细胞放到autoMACS的上样通道。选择possel程序，这样标记的细胞将从阳性通道洗脱。

7.将细胞悬液在4℃，200g离心10min。弃上清后将沉淀用2~5m1RPMI10完全培养基混悬。计数。

流式细胞术分离法操作步骤

一、试剂及配制       

1. RPMI-1640培养基：应选购不含酚红的，使用时加入5%的小牛血清。

2. FITC-抗CD3单克隆抗体：FITC为异硫氰酸荧光素，CD3为T细胞表面特有的蛋白质分子（分化抗原）。 

二、操作方法    

1. 用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度离心法分离单个核细胞，用RPMI-1640培养基配成1×10^7 /ml；

2. 加适量FITC-抗CD3，4℃孵育30min，用RPMI-1640培养基洗2次；

3. 用流式细胞仪进行分析。在散射光参数图上选取淋巴细胞群，在荧光参数图上选取绿色荧光阳性的细胞进行分选。

三、注意事项

1. 分选细胞常常用于细胞亚群的进一步的功能研究，因此，整个过程均需要严格无菌操作，并且在进行流式细胞仪进行无菌冲洗。      

2. 此法分离得到的T细胞纯度可达到99%，收获率可达到90%。      

3. 由于喷嘴孔很小（约70～100μm），分选前用30～40μm孔径的滤网过滤细胞悬液，以免稀薄凝块堵塞喷嘴。    

T细胞的培养

对实验室以及培养过程中所接触的试剂、液体、器皿、仪器的消毒,均应严格按照有关细胞培养的参考书的要求进行操作。无菌观念要贯穿整个实验的始终,不可松懈。  

二、培养器皿的选择　

淋巴细胞培养既可选择培养板(24 、48 、96 孔) 、培养瓶,也可选择三角烧瓶、试管等器皿进行培养。有研究表明提取的淋巴细胞用1.5ml 离心管培养72小时,细胞生长状况良好。用青霉素小瓶进行培养,淋巴细胞生长也非常好。

可以认为,对散在的细胞培养来说,用小器皿具有以下优点:

(1) 便于操作:1. 5ml 离心管为一次性使用,青霉素小瓶可反复刷洗,而培养板、培养瓶价格偏贵且用过几次之后,便有些模糊不清,尤其是塑料的。更为重要的是,淋巴细胞培养为悬浮培养,在培养过程中需要不断晃动,而大多数实验室没有恒温摇床。我们发现,在培养过程中每隔6～8小时晃动一次培养器皿,便可解决这个问题。青霉素小瓶、1. 5ml 离心管晃动起来相对容易些。    

(2) 减少污染:因为淋巴细胞培养的液体量较少,一般为100～ 200μl , 故文献资料中多见用培养板( 48 、96孔) ,少见用培养瓶。对分散的淋巴细胞培养,一方面一次用不了那么多孔,另一方面一旦一孔有污染,其他孔便有可能被波及,使其他孔的培养也失败。而且,晃动培养板时,很容易使液体溅到培养板盖上,增加污染的机会。而使用青霉素小瓶、1. 5ml 离心管等小器皿便可避免这些现象,但缺点是不易观察细胞生长,需取样加到载玻片上观察。

三、血清的选择

淋巴细胞对血清的要求较高,所以选用血清时要注意生产厂家。但胎牛血清价格昂贵,新生小牛血清或小牛血清也价格不菲,而使用自身血清不仅细胞长得好,而且更接近体内环境,避免了外来因素的干扰,使实验设计更严密。血清浓度在5 %～20 %时细胞生长比较好,当超过30 %时反而不利于细胞生长。 

四、pH 值

细胞生长的最适pH 为7. 0～7. 2 ,可忍耐的pH 范围为6. 6～7. 8 ,当pH 低于6. 8 或大于7. 6 时, 都会抑制细胞生长 。RPMI1640 培养基加入血清后pH 值一般升高0. 2～0.4 ,故配1640 培养液及其他用液时使pH 值达到7. 2比较合适,并且需经常检测pH 值。       

五、培养空间

培养液与液面上的空间二者的体积比例一般以1∶10 为宜,培养液液面高度最好维持在2～5mm 的范围,以便于气体交换 。      

六、恒温培养箱

温度应维持在37 ℃,CO2 浓度为5 % ,O2 为95 % ,100 %的饱和湿度。 

培养过程中出现的常见问题   

1.　污染　污染仍是细胞培养失败的主要原因,包括细菌和真菌,中药制剂尤易出现真菌污染。支原体污染不易发觉,但对细胞生长影响较小,尤其只培养72 小时。一般是分离过程中的用液和培养基出现了污染。

2.　pH 值　过高或过低,或培养过程中瓶塞不紧,CO2 逸出,导致pH 值上升。

3.　诱导剂 淋巴细胞在体内外一般是不分裂的,在培养过程中须添加刀豆球蛋白(ConA) 、脂多糖(LPS) 、白细胞介素2 ( IL - 2) 、植物血凝素(PHA) 、丝裂霉素等促分裂剂和抗原物质。须注意它们的浓度及是否失效。   

4.　培养器皿洗涤不干净,有蜡、油污或酸残留。    

5.　培养用液含有杂质,配制过程中所使用的各种溶液必须用三蒸水,若含有Fe 、Ca 等离子及杂质,可影响细胞的增殖 。

6.　接种的细胞数目过多或过少,或提取的淋巴细胞中混有大量红细胞 。

7.　血清质量不佳。

8.　恒温培养箱的CO2 、温度等不稳定。    

9.　存在个体差异　在相同条件下,某一受试者的血培养不成功,而对照实验培养结果正常,其原因有时无法查出。淋巴细胞的生长情况,还与受试对象的年龄有关,青年人的淋巴细胞比中、老年人的生长得要好。