开展细胞相关研究之前需要确定
1. 根据可靠的信息来源选择细胞株
首先我们应该从可靠的数据库/资源库(如Cellosaurus数据库、ATCC、DSMZ数据库等),根据细胞的基因型、表型及起源等信息来选择适合实验的细胞株。
2. 查询目标细胞株是否存在既往错误识别/被污染的情况
如果目标细胞株存在既往交叉污染、标签标记错误或其他原因造成的错误识别/被污染,其遗传信息与原始来源不再保持一致。在获取、培养细胞时需要额外注意。ICLAC建立的Register of Misidentified Cell Lines可以帮助查询。
3. 从可靠、规范来源获取细胞
我们应该从原始来源的研究所或机构获得细胞株,例如权威的细胞库或者细胞系最初建系的实验室或机构。从其他渠道获得的细胞株,包括转赠、实验室间交换,都有很大的风险得到错误识别或被污染的细胞。如果一定要互相供给细胞,应每次要求供应方提供细胞株已做过鉴定的证据,并检查供应方是否有信誉,以确保细胞系的准确无误。
4. 细胞身世了解(成长经历)
当我们接触新的细胞系/进入新的工作环境时,需要了解细胞系此前的培养条件(包括培养基、血清、环境条件等)、既往是否发生过微生物污染、有没有定期进行细胞鉴定等。
5. 及时进行细胞鉴定
当细胞株建系时、细胞株进入新实验室时、准备新的细胞库时,都必须进行细胞鉴定。如果将其用于实验,细胞应当在实验开展之前和实验结束之后(即文章投稿之前)进行鉴定。细胞株在长时间培养之后、发生任何遗传修饰及选择后以及表型发生变化时也应当及时进行鉴定。
细胞系身份认证的技术
由于细胞状态、表达模式会随着细胞传代和培养条件的变化而变化,因此基于表型的分析并不适合进行细胞鉴定。细胞基因型分析可以区分不同来源的细胞株。目前使用的最多认证技术为STR和单核苷酸多态性(SNP)鉴定。
1. STR鉴定
由于具有高灵敏度、自动化程度高、准确快速、重复性好等优点,STR基因分型已被认定为细胞鉴定的金标准。其根据细胞系遗传特性建立细胞系信息,通过与权威的细胞STR数据库比对来确定是否发生交叉污染或误认。
例如,对从不同比例的AU565(人乳腺癌细胞):Panc 08.13(人胰腺腺癌细胞)细胞中提取的DNA进行了STR测定。下图a中为16种STR标记中的5种(D3S1358、THO1、D21S11、D18S51和Penta E)的电泳图示例,数字比例表示AU565:Panc 08.13细胞的相对丰度(例如,99:1表示99%的AU565与1%的Panc 08.13混合)。下表b展示了所有受测细胞STR结果与STR数据库相比较的匹配度。
2. SNP鉴定
虽然这种方法不是细胞鉴定的标准方法,但如果目标细胞通过STR分型被证明正确的,则这种方法可以用于内部测试(例如,作为高通量测序分析的一部分)。已经证明,几组SNP位点能够有效的对人源细胞进行鉴定。
3. 其他方法
STR和SNP均具有较高的灵敏度,可鉴定低浓度污染,但并非适用于全部细胞系/所有物种。当物种不适用时该如何鉴定我们的细胞系呢?
DNA条形码技术是进行细胞物种鉴定的标准化、共识的方法,其基于对线粒体基因细胞色素c氧化酶亚基1(通常称为CO1, COI1或COX1)测序结果以进行分型。物种特异性多重PCR分析也可以快速确认细胞的物种来源。
合理的库存维持流程
科学家Mamie Yu给出了一种细胞系库存维持建议的流程。每个步骤都需要质量控制,以避免人为错误和污染。
在收到一个细胞系(原瓶)后,要对其进行扩增,最好是在一个单独的超净台中,专门用于处理新的细胞系。将细胞系的信息储存在数据库中,做好记录备份。对细胞进行支原体和跨物种PCR分析的检测,并使用STR和SNP指纹图谱以确认细胞身份。
初始扩增后的细胞被存储为“主储备”,以保持细胞系的低传代来源。然后对这些细胞进行再次扩增,检测支原体,并作为“工作储备”储存起来。取其中一个样本复苏扩增,以确定细胞的活力(解冻质量控制)。在使用这些工作储备前,仍需进行支原体、跨物种污染检测和SNP基因分型以控制质量。在“工作储备”超过“主储备”的(最多)20倍之后,则需要弃用旧的“工作储备”,从“主储备”扩增产生新的“工作储备”。
同时,在任何阶段的质量控制失败都需要重新检测,因为可能会出现假阳性或样品混淆的情况。在初始扩增后,所有后续的重新扩增或常规质量控制,都要使用SNP平台进行监测。将细胞系注释与数据库中的STR/SNP图谱联系起来,为将任何基于细胞的数据与原生细胞系联系起来提供了基础,从而有利于数据整合和比较。
防止细胞交叉污染的建议
尽管ICLAC提出的细胞株鉴定指南和建议十分详尽,但仍可提取一些关键信息:
1. 开始实验前:需要在权威数据库(如ICLAC)进行检索,以查看细胞株相关遗传信息、了解是否为已知的错误识别或污染。
2. 获取细胞株:需要从可靠权威的单位购买,并要求供应方提供相应的细胞株身份证明,尽量避免从二手渠道(如实验室间的交换)获取细胞株。
3. 细胞株鉴定:在获取细胞株保藏前、实验开始前、论文投稿前、长时间传代后、发生遗传修饰/表型变化后均应当及时进行鉴定。
4. 细胞培养准备工作:根据已了解的细胞特性,提前准备好合适的培养基和血清等,沿用此前的培养条件进行扩增。
5. 避免交叉感染:
(1) 避免同时处理生长快和生长慢的细胞
(2) 在接触细胞后,不要将移液管放回培养基或试剂瓶
(3) 避免气溶胶在敞开的培养物间传递
(4) 避免使用未塞棉花的移液管
(5) 避免在冻存、复苏和培养时错误标记
(6) 必要时进行细胞株鉴定和微生物(支原体、细菌、真菌等)污染检测
(7) 定时观察培养物状态、保证检测的真实有效
(8) 尽量避免共用培养基和(或)移液管
6. 细胞鉴定方法:可使用STR或SNP分型。
7.细胞污染的处理方法:细胞又被污染了?一文教你如何预防及挽救!(点击查看,解决方案)