转染，指将某种物质转移到细胞内。在生物医学研究中，这个“物质”通常指的是DNA或RNA。通过转染，我们可以向细胞引入新的基因，或者沉默或敲低细胞内的某个基因，从而研究该基因对细胞生命活动的影响。
一、转染的分类
1、根据转染物质的种类，转染可分为DNA转染和RNA转染。
DNA转染：是指将外源DNA分子导入真核细胞的过程，它是真核细胞主动或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。通常用于基因表达和蛋白质合成的研究。
RNA转染：指将RNA分子导入细胞的过程，则主要用于干扰RNA的研究，以探究特定基因的功能。
2、根据转染的稳定性和效率，转染又可以分为稳定转染和瞬时转染。
稳定转染：是指外源基因（DNA/RNA）整合到宿主基因组上，转染细胞及其子代细胞的基因组中会同时保留转染的DNA，其效率较瞬转低。
瞬时转染：则是指外源基因（DNA/RNA）不整合到宿主基因组上，仅在细胞分裂周期内表达，通常仅持续几天，直到外源基因在细胞分裂过程中因各种因素丢失为止。主要用于启动子和其他调控原件的分析以及蛋白质的功能研究。
细胞中瞬时转染的外源基因表达多用于启动子和其他调控元件的分析。
两者的实验步骤相似，但在实验操作上有一定的差异。
首先，稳定转染和瞬时转染所使用的转染试剂不同。稳定转染通常使用脂质体等试剂，通过细胞内吞作用将外源基因整合到细胞基因组中。这些试剂可以促进外源基因与细胞表面的受体结合，从而实现基因的稳定转染。而瞬时转染则是使用聚凝胺等试剂进行转染，虽然这些试剂也可以促进外源基因进入细胞，但它们不会将基因整合到细胞基因组中。
其次，稳定转染和瞬时转染对外源基因的要求也不同。稳定转染通常需要使用具有复制能力的质粒或病毒载体，以便外源基因可以在细胞内稳定存在并整合到细胞基因组中。而瞬时转染则不需要使用具有复制能力的载体，因为外源基因只是短暂地表达，拷贝数会被稀释，无法达到持续表达外源基因的目的。
3、根据转染试剂的不同，可分为：化学转染、物理转染、病毒转染。
细胞由带负电荷的磷脂双分子层构成，这对大分子物质来说是个不可透过的屏障，比如DNA和RNA的磷酸骨架，其也带负电荷。目前主要有三种方法可以使核酸穿过细胞膜：
（1）化学转染：通过使用一些化学物质，如聚乙烯亚胺（PEI）、脂质体等，来改变细胞膜的物理和化学性质，使其对外源性DNA或RNA具有亲和力，从而实现基因转移。这种方法的优点在于可以通过控制化学物质的浓度和作用时间等因素来精确控制转染的效率和时间。
（2）物理转染：包括基因枪法和电击法。基因枪法利用高速运动的粒子，将DNA或RNA撞击到细胞膜上，从而进入细胞。电击法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入（实验条件控制较严、难度较大）。物理转染的优点在于可以直接将DNA或RNA导入到细胞内，而不需要使用任何化学物质。
（3）病毒转染：利用病毒作为载体，将外源基因包装后导入细胞。这种方法可以有效地实现外源基因的稳定整合和表达，同时具有较高的转染效率和安全性。常用的病毒载体包括腺病毒、逆转录病毒等。病毒转染的优点在于可以实现高效、特异性的基因转移，同时避免使用某些化学物质对细胞产生的负面影响。
然而，没有一种方法适用于所有的细胞和实验，理想的方法应根据细胞类型和实验需要进行选择，理想的方法应具有高转染效率，低细胞毒性和对正常生理学的影响最小，并且易于使用和可重复性等特点。
实验室使用较多的主要有化学介导中的脂质体转染（质粒转染）和生物介导中的慢病毒转染法。其中质粒转染操作简单，一般瞬时转染选择较多，但有些细胞系不容易转染，因此选择转染方式时一定要做足功课，亲身经历告诉我，千万不要图方便，否则转染效率简直崩溃。特别是养原代细胞的小伙伴，一点要认真选择！病毒转染一般具有能够稳定表达的优势，且其对原代细胞有较高的转染效率，其中更分为慢病毒转染，逆转录病毒转染和腺病毒转染，其中腺病毒转染可适合更为难转染的细胞，例如悬浮细胞、T细胞、raw细胞等难转染细胞。
二、 转染步骤
1、阳离子脂质体转染法
☆ 准备细胞：选择适当类型的细胞进行转染，并在转染前进行适当的培养，确保细胞处于对转染最有利的状态。
☆ 准备基因：将目的基因以合适的方式进行剪切和标记，以便于后续的检测和筛选。
☆ 制备转染载体：选择适当的转染载体，如脂质体、病毒等，将目的基因包裹在转染载体中（这个步骤是载体构建，将目的基因插入到转染载体中，形成重组目的基因片段，并利用这种重组片段转染目标细胞，从而将目的基因导入细胞中）
进行实验之前，请先规划好实验，一般细胞转染需要24h-72h，所以要充分了解细胞生长速度，计算所需脂质体和DNA的储备量，并确认准备好所需试剂：无血清培养基，Lipofectamine转染试剂，以及DNA。
☆ 进行转染：按照生产商提供的标准操作流程，将转染载体导入受体细胞。（配好的转染试剂逐滴加入到每个孔的培养基中，按十字方向轻摇混匀）
☆ 进行下一步实验
2、慢病毒转染法（贴壁细胞）
☆ 准备细胞：转染前18-24小时铺板（密度约为5×104个/cm2），使细胞在慢病毒转染时的密度约为1×105个/cm2。
☆ 进行转染：第二天，用含有6 μg/ml polybrene的新鲜培养基替换原培养基，加入适量病毒悬液,37℃孵育。(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后加入2ml新鲜培养基以稀释polybrene。继续培养24小时，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。
如果慢病毒含有荧光蛋白，一般转染48小时后可见明显荧光表达，72小时后更加明显。如需FACS检测转染效率，可在转染后72-96小时进行。如果慢病毒含有抗性基因并且需要加药筛选，可以在转染3-4天后开始加药。
☆ 悬浮细胞：不用等贴壁直接转。
注意：转染载体是指在基因转染过程中，用于帮助目的基因进入宿主细胞的一些辅助因子。这些载体可以是质粒、病毒、人工染色体或其他能自主复制的DNA分子。
在转染过程中，目的基因通常被插入到载体中，以便于将其导入宿主细胞。载体可以将目的基因带到细胞内部，并确保其在细胞内稳定存在和表达。常见的转染载体包括质粒、噬菌体、反转录病毒、慢病毒等。
其中，质粒是最常用的一种转染载体，它是一种小型环状DNA分子，可以在细胞内自主复制。噬菌体则是一种病毒，它能够将其遗传物质插入到细菌细胞中，并利用细菌的细胞器进行自我复制。反转录病毒和慢病毒则可以感染哺乳动物细胞，将外源性基因导入细胞内进行表达。
2、siRNA转染步骤
☆ 设计siRNA：首先，需要基于目标基因序列设计siRNA。可以使用在线工具或商业实验室进行设计（Like us）。一般建议设计2-3条siRNA并进行验证，以确保特异性和有效性。
☆ 合成siRNA：将设计好的siRNA通过化学合成方法制备出来，并进行纯化和浓缩。通常选择购买现成的siRNA（We have what you want），也可以使用自行合成的siRNA。
☆ 细胞培养：将所需的受体细胞培养到适当的数量和密度。在转染前应确保细胞处于快速增长期，并且细胞状态良好。
☆ 转染siRNA：根据转染试剂说明书或实验室标准操作流程，将siRNA转染到受体细胞中。☆ 鉴定：转染后需要对细胞进行恢复培养，通常24-48小时后可以进行下一步操作。
三、 注意事项：
（1）转染试剂不同细胞系转染效率通常不同，但细胞系的选择通常是根据实验的需要，因此在转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂。每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献，通过这些资料可选择最适合实验设计的转染试剂。当然，最适合的是高效、低毒、方便、廉价的转染试剂。不同转染试剂有不同的转染方法，但大多大同小异。转染时应跟据具体转染试剂推荐的方法，但也要注意，因不同实验室培养的细胞性质不同，质粒定量差异，操作手法上的差异等，其转染效果可能不同，应根据实验室的具体条件来确定最佳转染条件。细胞转染效率往往受到很多因素的影响，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。
（2）细胞状态和密度转染前细胞的状态和密度都非常影响转染效率和后期的实验结果。最适合转染的细胞是经过几次传代后达到指数生长期的细胞，细胞生长旺盛，最容易转染。细胞状态不好，会导致转染效率低下，为确保良好的细胞状态需注意以下几点：
■ 一般会选择复苏细胞传代3-4次（汇合率达到90%之前对细胞进行传代，不要长到100%）。
■ 如果提总蛋白，一般选择六孔板进行转染，因为转染的细胞提取蛋白的总量能达到200ug，一般够做并且需要的DNA和Lipofectamine又相对比较少。
■ 传代条件取决于所用的细胞系。对于快速生长的细胞，倍增时间为16小时(如HEK293)。对于生长缓慢的细胞，倍增时间为36小时(如原代细胞)
■ 转染当天，将细胞铺板。如果在转染前一天或更早时间铺板，转染效率可能下降，如果是简单细胞系的转染，可以直接在前一天晚上铺板，第二天来转染。转染时，细胞密度会影响转染效率，细胞密度保持在汇合率为70-90%（这个前提是转染24h，如果转染48h则需要汇合率为50-70%），细胞的铺板和转染也可同时进行。
（3）使用优质DNA DNA的质量影响转染效率：
■ 脂质体转染基于电荷吸引原理，如果DNA的纯度差，则其携带的少量的盐离子、蛋白、代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的效率。
■ 含有内毒素的质粒对细胞有很大的毒性作用。为实现高效率、低毒性的转染，应使用高质量的DNA（高纯度、无菌、无内毒素）。
■ 使用无内毒素的试剂盒和实验方案制备DNA。
■ 通过测量OD值来确定DNA纯度和浓度，OD 260/280 值应介于1.7-1.9之间，越接近1.8越好。读数小于1.8，表明样品可能被芳香族产物（即苯酚）或蛋白质污染；读数大于2.0，则表明样品被RNA污染。
■ 当转染的DNA会编码对细胞有毒害作用的产物时，可使用弱启动子或可诱导的启动子限制毒性基因产物表达对细胞造成的损害。
（4）选择合适浓度的DNA不同细胞系转染效率通常不同，需要进行预实验，选择合适浓度的DNA，以获得较高的转染效率。转染时各种培养皿添加质粒和脂质体参考量见下表：（不同的质粒和脂质体最佳搭配比例不同，转染前，应该摸一个最佳配比）。
（5）转染时，小心轻柔的将脂质体加到培养基中并轻轻混匀，避免粗暴用力吹打，会导致脂质体失效。
（6）血清脂质体转染过程中，血清会影响复合物的形成（蛋白质可能会干扰复合体的形）。一旦复合体形成，即可将其加入到含血清培养基的细胞中。
（7）在转染的过程中不使用抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。
（8）转染分子类型
质粒DNA 是最常用的转染载体。质粒 DNA 的拓扑结构（线性或超螺旋）和大小会影响转染的效率，超螺旋质粒 DNA 瞬时转染的效率最高。在稳定转染中，相对于超螺旋 DNA，虽然使用线性 DNA 会导致细胞的 DNA 摄取量较低，但 DNA 整合到宿主基因组中的效果更优。虽然寡核苷酸、RNA、siRNA 和蛋白质等其他大分子也可以转染到细胞中，但在使用这些大分子时，需要优化转染条件。
（9）转染完成后需要对转染效率进行检测，常用的转染效率检测方法有以下几种：
■ 设置阴性和阳性对照：一般在转染后24-48h，靶基因即在细胞内表达。可依据不同的实验目的，24-48h后即可进行靶基因表达的检测等实验。■ 使用荧光显微镜或流式细胞仪可以测定转染细胞和 GFP 蛋白表达细胞的百分比。利用含 GFP 或 RFP 之类报告基因的质粒作为阳性对照（阳性对照可以放在一个单独的孔中，或是与目的质粒共转染），评估转染效率。
■利用 qPCR 法精确定量目的基因。
■ WB检测敲减或者过表达蛋白。
（10）转染后发现转染效率不高，可以通过两种方法：1、复转染，即转染后12-24小时再次进行转染，前提是该细胞对脂质体的耐受性较好，转染后细胞死亡数较少。2、通过药筛来杀死未转入成功的细胞。前提是该质粒带有抗生素抗性的基因。
常用于转染的细胞类型
人胚胎肾细胞（HEK293）：这种细胞系具有高转染效率和稳定性的特点，常用于基因克隆和疫苗生产。
人宫颈癌细胞（HeLa）：这种细胞系具有高分裂速度和稳定性的特点，常用于基因功能研究和蛋白质生产。
人骨髓瘤细胞（U266）：这种细胞系具有高分化度和稳定性的特点，常用于基因克隆和药物筛选。
小鼠胚胎成纤维细胞（NIH3T3）：这种细胞系具有低免疫原性和高分裂速度的特点，常用于基因敲除和药物筛选。
大鼠胶质瘤细胞（C6）：这种细胞系具有高分化度和稳定性的特点，常用于药物筛选和肿瘤研究。
需要注意的是，不同的细胞类型具有不同的转染效率和特点，实验人员需要根据具体实验需求和细胞特点选择适合的转染方法和技术。
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