有时候做WB跟打王者一样想超神carry看似很困难实则一点也不简单，因为在大多数实验步骤中，电泳和湿转条件都是经验性的，实验试剂的厂家、浓度及实验室习惯等条件影响，网络上诸多经验性的实验方法可能并不适用于所有实验，所以卡好“红蓝buff”进行考马斯亮蓝或丽春红预染可以猥琐发育让实验事半功倍。
在此，推荐进行预实验确定实验步骤的所有时间条件，而预实验中实验条件的确定依赖两种常用的染色方法，即考马斯亮蓝染色（Commassie Blue Fast Staining Solution）和丽春红染色（Ponceau S Staining Solution）。
那么丽春红和考马斯亮蓝两种染料，到底选择哪种比较好呢？
一、SDS-PAGE凝胶染色:考马斯亮蓝染色(Commassie Blue)
SDS-PAGE胶的染色可用于评估电泳和湿转条件是否合适，最常用的方法是蛋白分离情况。考马斯亮蓝染色又称Bradford法，是 Bradford 于 1976 年建立起来的一种蛋白质浓度的测定方法（【Western-Blotting】蛋白提取与蛋白定量）。考马斯亮蓝染色有G250和R250两种，在酸性条件下，R250和G250可与蛋白质中的精氨酸、赖氨酸和组氨酸（arginine, lysine and histidine）结合；R250与蛋白结合后呈红色-粉红色，G250与蛋白结合呈绿-蓝色。考马斯亮蓝染色具有容易检测、高灵敏度（可检测低至0.5ug/cm²的蛋白）和可逆性染色等特点。
在WB中常对SDS-PAGE进行考马斯亮蓝染色，在电泳结束后进行考马斯亮蓝染色可根据SDS-PAGE胶上条带位置、形状及条带间的间距等推断蛋白分离情况，从而评估电泳条件是否得当及SDS-PAGE制备情况；在湿转结束后进行考马斯亮蓝染色可根据不同位置的条带深浅程度等评估不同分子量蛋白的残余程度，从而评估湿转条件是否足够。
Tips：
1、考马斯亮蓝染色因高背景，并不推荐PVDF膜或者NC膜的染色；
2、尽管考马斯亮蓝染色可逆，但需要改变染色条件（可能影响SDS-PAGE的稳定性等），因此，SDS-PAGE进行考马斯亮蓝染色后不宜进行下一步的转膜。
考马斯亮蓝快速染色液操作步骤：
1. 电泳结束后，取胶放入约50-100ml蒸馏水中，在摇床上摇动5分钟，倒弃液体，再重复两次， 共洗涤三次。注：本步骤的目的是为了洗去凝胶中的SDS等干扰物质。如果不能充分去除SDS会导致背景较 高，如果胶非常厚，每次的洗涤时间需适当延长并且洗涤次数也需适当增加。蒸馏水洗涤去 除凝胶中的杂质时，如果使用经过加热至接近沸腾的蒸馏水，每次洗涤1-2分钟即可。
2. 弃蒸馏水，加入适当体积的考马斯亮蓝快速染色液，使染色液能盖住凝胶，且液面至少高出 三个胶的厚度为宜，在侧摆摇床或水平摇床上进行染色。
3. 根据蛋白量的多少，蛋白量大的条带10-30分钟左右会出现，大部分蛋白条带会在1-2小时左 右出现。如果希望获得染色灵敏度更高的结果或希望加快染色进程，可以把凝胶放置在考马 斯亮蓝快速染色液中在95-100℃水浴或烘箱中加热或使用微波炉加热。加热至约95-100℃后， 在摇床上进行染色。染色液稍冷或冷至近室温后可以继续同前进行加热和摇床染色，可以重 复2-3次。注：染色时如果把凝胶和染色液一起放置在微波炉中适当加热，可以大大加快染色速度。但 加热时宜尽量避免沸腾，以免出现因暴沸而导致的凝胶碎裂。
4. 染色至看到清晰的目标蛋白条带后即可停止染色。弃染色液，加入适量的蒸馏水，停止染色 反应。然后即可拍照记录。注：通常使用本染色液染色后背景非常低，如果希望获得更加清晰的蛋白条带，可以加入适 量的室温蒸馏水进行洗涤。通过蒸馏水洗涤可以进一步降低背景。在4℃蒸馏水中浸泡过夜可 以获得背景更低，条带更清晰的条带。在次日对4℃蒸馏水浸泡过夜的已经进行了染色的凝胶 再同前一天一样进行染色和洗涤可以进一步改善染色效果，获得更好的考染蛋白条带。
常见问题：
1. 无染色条带：可能上样量太少，建议电泳时加适当量的BSA等作为阳性对照。
2. 背景太高：可能杂质没有除尽，建议延长最初的蒸馏水洗涤时间或增加洗涤次数。也可以在完成染色后，把凝胶放置在蒸馏水中在室温或4℃进行洗涤。在4℃蒸馏水中浸泡过夜，通常可以取得较好的脱色效果。
3. 染色条带的灵敏度不够理想：可以使用考马斯亮蓝快速染色液进行重复染色，重复染色可以改善染色效果。在加热情况下染色可以显著提高检测灵敏度，另外染色后在室温或4℃用蒸馏水进行脱色也可以显著改善染色的灵敏度。
二、NC膜/PVDF膜的染色：丽春红染色 Ponceau S
NC膜/PVDF膜的染色常用于评估转膜是否充分，最常用的方法是丽春红染色。丽春红染色带负电，可以与带正电荷的氨基酸残基结合，同时丽春红也可以与蛋白的非极性区相结合，从而形成红色的条带。因其染色的可逆性（容易被dd水、PBS等洗脱）及反应快速（一般仅需5-10分钟），丽春红染色被广泛应用。一般会根据转膜后SDS-PAGE的考马斯亮蓝染色（是否有蛋白残余）和NC膜/PVDF膜的丽春红染色（转膜是否充分）综合评估转膜条件是否得当。
Tips：为保证实验准确性及为排除抗体原因导致阴性结果，有的研究者习惯在转膜后进行丽春红染色。
丽春红染色液介绍：
丽春红染色液（又名酸性红112，也有人叫猩红）是一种红色染料，也是一种重氮染料，用于WB中蛋白质的可逆染色。1986年，O Salinovich和R C Montelaroused 首次将其作为考马斯亮蓝色染色的替代品。
丽春红染色液是用于蛋白质染色的众多染料之一。不同的染色液具有不同的结合特性和检测下限。
丽春红染色液既可以对NC膜进行染色，也可以对PVDF膜进行染色。注意通常不对尼龙膜进行染色，因为染色液和尼龙膜强烈结合并产生高背景。
丽春红染色液的检测蛋白质的下限是200ng。
虽然丽春红染色液的检测能力很低，但由于其染色的可逆性和与其他染色液相比价格低廉，它是最常用的染色液之一。
由于可逆染色（对蛋白质没有不利的影响），所以染色后的样品可用于其他下游检测，如免疫印迹和蛋白质测序等。
丽春红染色原理：
丽春红染色液本身带大量的负电荷，因此可以和氨基酸上的正电荷结合，另外丽春红染色液也能够和蛋白质的非极性区结合，从而使蛋白质呈现红色。
丽春红染色液应用：
（1）最常见的用途是WB实验中对蛋白质进行染色，以检测和观察蛋白质条带。
（2）丽春红染色液也可用于分光光度法对蛋白质进行定量。
丽春红染色操作步骤：
（1）取出待染色的膜，用TBST或PBST洗一遍。
（2）加入丽春红染色液将膜浸没，室温孵育1小时，染色时间相对灵活 直至出现清晰条带，对结果作适当记录。
（3）回收丽春红染色液（可以重复使用）用蒸馏水清洗去除背景。
（4）染色的膜可以在温室或者4℃保存。
丽春红脱色：
脱色液可用蒸馏水或者PBS。
