一质粒介绍

1.质粒

质粒是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。质粒常见于原核细菌和真菌中，绝大多数的质粒是DNA型的，少部分为RNA型。天然DNA质粒大都具有共价、封闭、环状的分子结构，其分子量范围为1-300 kb。

天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足基因工程载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。

2.质粒特点

1)自主复制：独立存在于细胞内的复制子。一般质粒 DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂而传给后代，按质粒复制的调控及其拷贝数可分两类：严紧控制(stringent control)型质粒的复制常与宿主的繁殖偶联，拷贝数较少，每个细胞中只有1 个到十几个拷贝；

另一类是松弛控制(relaxed control)型质粒，其复制宿主不偶联，每个细胞中有几十到几百个拷贝。每个质粒 DNA 上都有复制的起点，只有 ori能被宿主细胞复制蛋白质识别的质粒才能在该种细胞中复制，不同质粒复制控制状况主要与复制起点的序列结构相关。

3.理想的质粒应具备以下特性：

1)强大的复制能力：确保其在细胞内能够自主复制并大量繁殖，从而有效实现目的基因的扩增；

2)高效的表达能力：作为表达载体，应充分利用宿主细胞的酶系统，实现目的基因的有效表达；

3)高度的稳定性：确保质粒在细胞内能够持续稳定地复制和表达；

4)适宜的酶切位点：即应含有合适的限制性核酸内切酶识别和切割位点，以便于外源基因的插入；

5)明确的遗传标记：以便于对重组体进行筛选和鉴定；

6)较小的分子量：以便能够容纳较大的外源基因，提升质粒的实用性和应用范围。

4.按受体细胞的类型分类：原核载体、真核载体和穿梭载体。

1)原核载体(prokaryotic vector)：即能在原核细胞中复制和表达的载体。

2)真核载体(eukaryotic vector)：即能在真核细胞中复制和表达的载体。

3)穿梭载体(eukaryotic vector)：也叫转移载体(transfer vector)，兼具原核载体和真核载体的双重特性，同时包含原核复制起点和真核复制起点，既能在原核生物中高效复制和表达，又能在真核生物中稳定遗传并调控基因表达。如用于枯草杆菌的 pBE2、酵母菌的 pPIC9K、哺乳动物表达载体pMT2 和用于植物细胞的 Ti 质粒，这些穿梭载体不仅可以在大肠杆菌中复制扩增，也可以在相应的枯草、酵母、动物或植物细胞中扩增和表达。

5.按功能与应用分类

1)克隆载体(cloning vector)：此类载体具备携带外源基因的能力，可在宿主细胞内进行复制扩增。主要用于克隆和扩增DNA片段(基因)，但不包含启动转录、翻译等功能的元件。

2)表达载体(expression vector)：除包含克隆载体的基本构成元素(如ori、Ampr、MCS等)外，还具备转录和翻译所必需的DNA序列，即插入的目标基因，。

3)干扰基因表达载体：该载体主要用于干扰特定内源性基因的表达，其上含有针对目标基因mRNA的shRNA，从而发挥沉默基因表达的作用。

4)病毒载体：此类载体基于病毒基因组改造而成，通过去除其致病性并保留其感染性等特性，可进一步包装成病毒颗粒。这为功能基因进入靶细胞或整合至基因组提供了极为便利的手段。

6.根据质粒拷贝数分为松弛型质粒和严谨型质粒

1) 松弛型质粒：复制子决定了质粒的拷贝数，调节pMB1质粒复制子的是一种RNA分子，通常具有比较高的拷贝数，其复制的时候不需要自身合成蛋白，并且完全依赖宿主细菌或细胞提供的蛋白质，这一类就是松弛型复制，即使宿主挨饿受冻，它依然不停复制。使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝。

2) 严谨型质粒：严谨型质粒拷贝<10 个，像pSC101这一类的质粒需要自身合成RepA蛋白，一旦细胞蛋白质合成受阻，拷贝数就不能增加。

拷贝数是指每个细菌/细胞内质粒的个数，决定了最终所能获得质粒的量。质粒的复制子决定了质粒的拷贝数。质粒的拷贝数与正调控与负调控的相对强度相关，也可通过对复制子进行突变而改变。例如，pMB1的复制子能达到的拷贝数为15-20。pMB1的复制子经过改造，得到的pUC质粒拷贝数能够达到500-700。确实，低拷贝数的质粒用途不是十分广阔，主要用于以下两点：

(1)扩增大片段或者在高拷贝数质粒扩增时具有致死的基因克隆。

(2)质粒的扩增会占用大量资源，当载体用于表达或者其他用途时，也会使用上低拷贝质粒。

7.质粒的命名

如pUC19、pEGFP-N3，小写字母p代表质粒“plasmid”，2-4个大写字母代表发明者、实验室名称或者其他表型性状(CMV是启动子，EGFP是增强型绿色荧光蛋白)。

二、质粒的基本元件

1.复制起点（Origin of replication，ori）

DNA复制起始位点ori负责控制质粒复制的起始，原核生物DNA分子中只有一个复制起始位点；而真核生物DNA分子有多个复制起始位点。若质粒图谱上只有一个ori，表示质粒是原核克隆及表达质粒；而图谱上有两个ori，则表示该质粒是穿梭质粒，既可以在原核也可以在真核中复制。

2.启动子（promoter, P）

与RNA聚合酶特异性结合，促进基因转录的DNA序列。含有RNA 聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列。

真核细胞含有三类RNA聚合酶，因此真核启动子还分为I、II、III类启动。常见表达或者过表达都是II类启动子，而III类启动子如U6、H1，启动小片段如miRNA、shRNA、sgRNA等，其用于构建shRNA和sgRNA载体进行敲低或敲除操作。

Ⅱ型启动子在使用特点上又可分为三大类：组成型启动子（广泛性启动子）、组织特异性启动子、诱导型启动子。

此外，不同物种的表达体系具有不同的启动子，启动子启动基因表达也有强弱之分，因此我们需要根据自己的需求选择含有相应启动子的质粒。关于启动子的详细介绍见往期推文。

3.增强子（enhancer）：增强目的基因转录

4.筛选标记（selectable markers）

多为抗生素抗性基因，方便后续筛选阳性克隆。原核细胞筛选标记常用的是氨苄青霉素/氨苄西林Amp、氯霉素Cam、卡那霉素Kan、四环素Tet等；真核细胞筛选标记用的是嘌呤霉素Puro，新霉素neo/G418，潮霉素Hyg或Hygro等。质粒图谱中用抗生素缩写+R表示，R代表resistance，如AmpR和PuroR等。

5. 多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）

6.转录终止信号（polyA  signal）

转录到AAUAAA（AATAAA）之后，mRNA会接上polyA并转录终止。常见的转录终止信号位SV40 polyA，简写为SV40 pA

可以用激光激发产生荧光的蛋白，一般会独立表达或和目的基因融合表达的方式被设计在质粒上，起到示踪、阳性检测、成像的作用。如RFP、mCherry、GFP和EGFP等。

8.蛋白标签

蛋白标签大多为较短的短肽，一般融合表达在目的基因的3’端或5'端，如flag、HA、myc和his等。有了标签，在缺乏针对目的蛋白的抗体时就可以很方便的对目的蛋白做检测了

9.其他调控元件

WPRE：来自土拨鼠肝炎病毒的转录后调节元件，放置在目的基因的上游，能加强目的基因的表达。

cPPT：来自HIV-1整合酶基因，增加慢病毒在宿主基因组的拷贝数，提高病毒滴度。

三、如何阅读质粒图谱

1.首先看箭头方向

质粒图谱上都会存在箭头，箭头方向可以代表转录方向如图中U6、hPGK、AmpR等启动子（白色箭头）的方向，也可以代表复制方向，即 ori（黄色箭头）的箭头方向。设计引物及插入目的基因的方向是根据转录方向（启动子方向）来定的。由于质粒是环状双链DNA，箭头可有顺时针和逆时针方向，代表两条DNA链，它的启动子在其中一条链上，而它的某些基因在另一条链上。

2.看ori鉴别质粒类型

质粒复制起点是质粒DNA分子上启动复制的特定区域，负责精准调控复制的起始，对于质粒的稳定复制至关重要，决定了质粒的宿主和拷贝数。它包含能被复制酶识别的特定序列，确保质粒在宿主细胞内的稳定高效复制，实现目的基因的高效表达。原核生物DNA分子中，仅存在一个复制起始位点，而真核生物DNA分子则具备多个复制起始位点。若质粒图谱中仅展示一个ori，则表示该质粒为原核克隆及表达质粒，适用于原核生物的复制过程。而若图谱上呈现两个ori，则表明该质粒具备穿梭质粒的特性，既能在原核生物中复制，也能在真核生物中复制。

3.看启动子确定质粒的作用

该质粒图谱中有7个启动子（白色箭头），U6启动子可用于构建shRNA和sgRNA载体；hPGK和AmpR启动子启动Puro和Amp抗性基因的表达，可用于筛选阳性克隆。T3和T7启动子分别是噬菌体T3和T7 RNA聚合酶的启动子，lac启动子是大肠杆菌乳糖操纵子的启动子，RSV启动子是rous肉瘤病毒增强子/启动子。

4.看筛选标记/抗性基因

多为抗生素抗性基因，用于检测和筛选含有质粒的细胞，主要分为原核筛选标记和真核筛选标记。在原核细胞的筛选过程中，常用的标记物质包括氨苄青霉素(Amp)、氯霉素(Cam)、卡那霉素(Kan)以及四环素(Tet)等；而对于真核细胞的筛选，则常采用嘌呤霉素(Puro)、新霉素(neo/G418)、潮霉素(Hyg)等作为标记。

5.看多克隆位点

是DNA载体上的人工合成序列，是外源基因的插入位点。MCS包含多个限制性酶切位点，每个限制性内切酶位点在整个载体质粒中是唯一的。一般可通过酶切后连接的方式将外源DNA插入质粒，多克隆位点一般位于转录启动和转录终止信号之间。

6.看转录终止信号

质粒图谱中pA或者poly A代表转录终止信号。

7.荧光标记

有的质粒带有荧光标记，用于直观判断质粒是否转染成功。