| 一、质粒是什么？
1.质粒
凡游离于原核生物核基因组以外，具有独立复制能力的小型、共价、闭合、环状的dsDNA分子，即cccDNA。通常都含有基因。
2.质粒特点
(1)自主复制：独立存在于细胞内的复制子。
(2)分子量小：大小一般为1.5~300kb。
(3)可转移性：同种细胞间-细胞分裂，不同种细胞间-接合、转化或转导。
(4)不相容性：任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中。
(5)遗传标记：常含有选择标记基因（如抗生素抗性基因），可以通过抗生素筛选来鉴定和分离含有质粒的细胞。
二、为什么质粒是基因工程中的明星？
1.分子量小，便于DNA的分离和操作。
2.呈环状，使其在化学分离过程中能保持性能稳定。
3.有不受核基因组控制的独立复制起始点。
4.拷贝数多，使外源DNA可很快扩增。
5.存在抗药性基因等选择性标记，便于含质粒克隆的检出和选择。
三、如何读懂质粒图谱？
1.质粒图谱概念
质粒DNA序列的物理图谱，包括质粒的大小、筛选标记、多克隆位点、转录及翻译元件等信息，为我们选择质粒、了解质粒特点及应用提供了重要依据。
2.质粒图谱包含的基本要素
(1)复制起点(ori)：控制质粒复制的起始点，决定了质粒的宿主和拷贝数。原核生物DNA分子中通常只有一个复制起始点，而真核生物DNA分子则可能有多个。
(2)筛选标记：多为抗生素抗性基因，用于检测和筛选含有质粒的细胞。常见的筛选标记：Ampr-氨苄青霉素抗性；Tetr-四环素抗性；Camr-氯霉素抗性；Kanr- 卡那霉素抗性；Hygr-潮霉素抗性。
(3)多克隆位点区(MCS)：外源基因的插入位点。包含多个限制性酶切位点的一段DNA序列；每个限制性内切酶位点在整个载体质粒中是唯一的；一般可通过酶切后连接的方式将外源DNA插入质粒；多克隆位点一般位于转录启动和转录终止信号之间。
(4)其他元件：比如启动子、增强子/沉默子、核糖体结合位点、转录终止信号等，这些元件对于质粒的表达和调控至关重要。
四、阅读质粒图谱的步骤
1.确定质粒类型观察Ori的位置和数量。只有一个Ori的质粒可能是原核克隆及表达质粒；有两个Ori的质粒可能是穿梭质粒，既可以在原核也可以在真核中复制。
2.看质粒元件箭头方向
质粒图谱上都会存在箭头，启动子（白色箭头）的箭头方向代表转录方向，ori（黄色箭头）的箭头方向代表复制方向。设计引物及插入目的基因的方向是根据转录方向（启动子方向）来定的。由于质粒是环状双链DNA，所以质粒图谱上有的箭头顺时针，有的箭头逆时针，指的是DNA的两条链，它的启动子在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条链上。一般情况下，顺时针代表阅读外圈（上链），逆时针代表阅读内圈（下链）。
3.查看筛选标记
识别质粒上的抗生素抗性基因，如AmpR、KanR等。这些标记决定了后续筛选时应该使用哪种抗生素。
4.分析多克隆位点（MCS）
仔细检查MCS上的酶切位点，了解哪些酶可以用于切割质粒以插入外源基因。同时，注意酶切位点的排列和位置，以便在构建质粒时选择合适的酶进行切割。
5.看外源DNA插入片段大小质粒通常仅能承载小于10 Kb的外源DNA片段。一般而言，外源DNA片段的长度越长，其插入的难度越大，稳定性也会相应降低，同时转化效率也会受到显著影响。
6.启动子(Promoter)驱动目的基因的转录，是决定基因表达水平的关键因素，选择合适的启动子可以确保目的基因的高效表达。常见的强启动子有CMV、EF1a等，中等强度启动子有SV40、mPGK、hPGK等，弱启动子有UBC等。
7.增强子(Enhancer)/沉默子(Silencer)为真核基因组（包括真核病毒基因组）中的一种具有增强邻近基因转录过程的调控顺序。其作用与增强子所在的位置或方向无关。即在所调控基因上游或下游均可发挥作用。
8.核糖体结合位点/起始密码/ SD 序列（Rbs/AGU/SDs）mRNA 有核糖体的两个结合位点，对于原核而言是 AUG（起始密码）和 SD 序列。
9.关注其他元件
查看质粒上是否存在核糖体结合位点(RBS)、终止子(Terminator)、操纵子(Operator)等元件。
10.蛋白标签蛋白标签通常为较短的短肽，一般通过融合表达的方式连接在目的基因的3’或5’端，常见的标签包括Flag、Myc、GST、HA和His等。
10.质粒图谱上的箭头：有的箭头顺时针有的箭头逆时针，那其实是代表两条DNA链，即质粒是环状双链DNA，它的启动子等在其中一条链上，而它的抗性基因在另一条链上。
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