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5个 WB 细节,教你拿到漂亮图
阅读:115次 | 来源:医学科研小坑 | 2024/8/23 18:15:27

小编整理了 5 个 WB 实验细节技巧,带你从细节手法出发,优化 WB 实验结果。5个 WB 细节,带你靠自己的双手,拿到漂亮图!

样本切记煮沸勿偷懒

煮沸的首要目的是使蛋白质完全变性,即破坏蛋白质的三级和四级结构,使其展开成线性形式。

这样,蛋白质分子在电泳过程中的迁移速率将主要取决于它们的分子量,而不是它们的构型差异。

将样本与加载缓冲液按 1:1 比例混合将混合后的样本在沸水浴中煮沸 5 分钟,这个步骤可以确保蛋白质的变性。

煮沸过程中,SDS-蛋白质复合物的形成更加均匀,有助于蛋白质在凝胶中的一致性迁移。

煮沸后立即将样品置于冰上冷却,这一步是为了终止变性过程,防止蛋白质在高温下过度降解或重新聚集。

  • 加载缓冲液的成分:0.5M Tris-HCl pH 6.8

作用:提供一个稳定的 pH 环境,有助于蛋白质在电泳过程中保持稳定。
  • 加载缓冲液的成分:2% SDS

作用:SDS 与蛋白质结合,形成复合物,使其带负电荷。
  • 加载缓冲液的成分:10% 甘油

作用:增加样品的黏度,有助于样品在凝胶孔中的均匀分布。
  • 加载缓冲液的成分:0.01% 溴酚蓝

作用:作为追踪染料,帮助观察样品在电泳过程中的迁移情况。
  • 加载缓冲液的成分:5% β 巯基乙醇

作用:有助于破坏蛋白质中的二硫键,进一步促进蛋白质的变性。

通过这些步骤,可以确保蛋白质在凝胶电泳中的表现更加一致和准确,从而得到可靠的实验结果。


电泳条件需谨慎遵循

电泳条件对于 Western Blot 实验的成功至关重要,因为它们直接影响蛋白质的分离效率和结果的清晰度,但是很多同学会「凑合用胶」,没有完全根据目标蛋白大小选择合适的凝胶浓度和电泳条件。

蛋白质分子量大小                  推荐凝胶浓度(%)                          推荐电泳电压(V)

10KDa以下                            15%-20%                                          100-150

10KDa-20KDa                       12%-14%                                          100-120

20KDa-50KDa                        10%-12%                                          100-150

50KDa-100KDa                      8%-10%                                             80-120

100KDa-200KDa                   6%-8%                                                 60-100

大于200KDa                           4%-6%                                                 40-80

不过也要注意,电压推荐是针对恒定电压条件下的电泳,实际使用时应根据凝胶的尺寸、电泳槽的类型以及具体的实验条件进行调整。

另外对于较小分子量的蛋白质,可能需要使用较高的电压以加快迁移速度,但要注意避免过热和条带压缩。

对于较大的蛋白质,使用较低的电压有助于减少条带压缩,但可能需要更长的电泳时间来确保充分分离。

最后,实验中可能需要根据具体的实验结果调整电压和凝胶浓度,以获得最佳的分离效果。


ECL 底物添加有技巧

提供足够的底物以产生稳定的化学发光信号。不过一定要严格按照制造商提供的说明书来配制 ECL 底物。很多同学在这步容易使用已经配置、使用过的 ECL 底物,可能会影响研究结果。操作步骤:
  • 配制 ECL 底物

目的和注意事项:按照说明书比例混合 A 和 B 组分,确保新鲜配制
  • 膜的预处理

目的和注意事项:确保膜完全湿润,无气泡,使用适当的缓冲液
  • 浸泡膜于 ECL 底物中

目的和注意事项:1 分钟,确保膜表面均匀覆盖,避免过长浸泡导致底物干燥或过度渗透
  • 去除膜表面多余底物

目的和注意事项:轻轻摇动或用滤纸吸去,减少背景噪音
  • 封闭袋内成像

目的和注意事项:根据信号强度调整曝光时间,进行成像初始曝光时间可以从短曝光开始(例如 5 秒或 30 秒),根据成像结果调整,一般会选择过曝前的 3-5 张结果来进行分析、使用。


使用手套做实验!千万别触碰

使用一次性手套在实验室中是基本的无菌操作要求,尤其在细胞间,但是出了细胞间,很多同学就开始用「回收手套」,甚至不戴手套拿个管子瓶子,这也会对 WB 实验带来交叉污染。
  • 可能影响:交叉污染

具体说明:皮肤油脂、死皮细胞或微生物可能污染样本,导致实验结果不可靠。预防措施:在处理样本前后更换一次性手套,避免接触不同样本时的交叉污染。
  • 可能影响:样品降解

具体说明:皮肤上的酶可能降解样本中的蛋白质,影响目标蛋白的检测。预防措施:使用手套防止皮肤直接接触样本。
  • 可能影响:膜损坏

具体说明:直接接触可能导致 PVDF 或硝酸纤维素膜的物理损伤。预防措施:佩戴手套以减少直接接触,使用镊子或专用工具操作。
  • 可能影响:试剂污染

具体说明:手套可以防止皮肤油脂污染试剂,保持试剂的纯净度。预防措施:始终佩戴手套处理试剂。

在实验过程中,除了佩戴手套外,还应根据实验内容采取其他个人防护措施,如实验室大衣、护目镜等。

通过遵循这些操作指南和注意事项,可以最大限度地减少实验过程中的交叉污染,确保实验结果的准确性和可靠性。

注意仪器的日常维护

最后的最后,别忘记提醒实验室研究员定期校准电泳仪和转膜仪,检查电压和电流的稳定性。

清洁和维护设备,确保无漏电或短路;校准应记录电压、电流和时间,确保设备在规定范围内运行。

日常维护:每次使用仪器后进行,主要是清洁工作,确保仪器表面和操作区域的清洁。

月度检查:每月进行,重点在于检查仪器的所有控制元件和指示系统是否正常工作。

季度检查:每 3 个月进行一次,电泳仪和转膜仪分别进行性能校准和温度系统检查,以确保设备性能稳定。

半年检查:每 6 个月进行深度清洁和安全检查,包括清洁难以触及的部分和检查电线、连接器等,以确保设备安全。

通过精确控制这些关键细节,相信大家也可以显著提高 WB 实验的成功率和结果的可靠性。拒绝科研造假,用自己的双手做出漂亮条带!


 

 
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