Western blotting（免疫印迹分析）是一种常用的蛋白质检测技术，用于检测样品中特定蛋白质的存在和定量。WB作为一个最为基础的生命科学检测方法之一，经过长时间摸索与分析，目前已经有了一系列适配性较高的通用WB实验检测方案和流程。但是蛋白质作为一个特异性较强的检测指标，总会有一些并不适用于常规化方法的个体，需要我们对实验步骤进行优化或者修改，才能保证得出一个较为理想的结果。
小分子蛋白
小分子蛋白主要指WB检测中小于20kDa的蛋白质，由于分子量小易降解，且带电荷量也相对较少，所以导致其吸附能力比较弱。常用的蛋白WB步骤通常会导致检测结果不稳定，时有时无，甚至出现转膜失败，蛋白弥散等完全看不到目标条带的情况。针对小分子蛋白的WB检测，应该对实验步骤进行优化，以提高结果的准确性。
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上样
通常Western Blot每孔上样量为30-50 μg，当蛋白分子量过小时，在跑电泳时容易出现较为严重的弥散情况，上样量建议选择50-100 μg。
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电泳
配置SDS-PAGE胶时，在高浓度的12%-15%的分离胶中进行电泳，同时加大浓缩胶的比例，使得浓缩胶与分离胶的比例约为4：6，甚至可以5：5，这样可以让小分子蛋白在浓缩胶中充分的浓缩，在后续的分离中减少弥散程度。
电泳时，以80v电压进行压缩，时间约为40min，电泳至两种胶的界面。然后将电压调整到100v，在12%-15%的分离胶中进行电泳，跑到分离胶一半的位置，一般10kDa的marker能够分开就可以了，目的是避免长时间的电泳使得小分子蛋白弥散。
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转膜封闭
小分子蛋白由于其分子量小，易降解，吸附能力弱，在转膜时一般使用0.22μm的PVDF膜，在转膜的时候，不要在转膜液中加入SDS，防止小分子蛋白与PVDF膜无法结合，可以将甲醇的浓度提升至30%，增强蛋白与膜的结合性。
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小分子蛋白实例详解
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IL-8 Rabbit mAb
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IL-8蛋白（interleukin-8 protein）是一种促炎性细胞因子，大小约为11kDa，通常由许多细胞产生，包括巨噬细胞、内皮细胞和上皮细胞等。IL-8在免疫应答中发挥关键作用，包括诱导中性粒细胞等免疫细胞向炎症部位迁移，并刺激这些细胞的激活。
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上样量：50ug；SDS PAGE：12%；电泳：浓缩胶80v，分离胶100v，目标蛋白附近的marker能够分开时就停止跑胶；转膜：0.22umPVDF膜，湿转80v，30min；实验结果：条带清晰，大小正常，无拖带弥散情况出现。
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大分子蛋白
大分子蛋白一般指分子量大于200kDa的蛋白质，由于其分子量大，迁移速度慢，转膜困难等特征，在WB中有时可能难以获得清晰的条带，因为这些蛋白质的迁移和转移可能会受到影响。
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电泳
大分子蛋白在电泳时，使用6%-8%的分离胶，200kDa以上建议6%进行分离，转膜时胶比较软，注意轻拿轻放，避免凝胶破碎，影响实验结果。
由于其较慢的迁移速度，建议使用低电压进行电泳。例如，可以选择在80-100V下运行整个凝胶。这有助于防止蛋白过快迁移并避免凝胶过热，同时增加电泳时间，使大蛋白有足够的时间迁移。
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转膜封闭
大蛋白的转膜通常比较困难，一般使用湿式转移并延长转移时间，保证蛋白活性和充分转膜。常用的转膜条件为80v，根据蛋白的大小，时间通常设定为3h-5h，甚至更久的转膜时间都是可取的。对于200kDa以上的蛋白，建议20v在4℃转膜过夜，可以得到比较好的效果。
大分子蛋白实例详解
p300蛋白是一种重要的转录调节蛋白，大小为300kDa左右，被称为组蛋白乙型丙酮乙酸转移酶，是胞浆酶的一种。p300在细胞核中发挥重要作用，参与许多细胞核过程的调节，包括基因转录、DNA复制、DNA修复以及细胞增殖和分化等。
上样量：20ug；SDS PAGE：6%；电泳：90V恒压跑完全程，增加跑胶时间，适当让小分子marker跑出蛋白胶；转膜：0.22umPVDF膜，20V湿转过夜；实验结果：条带清晰，大小正常，无拖带弥散情况出现。
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跨膜蛋白
膜蛋白在高温煮沸时，容易发生聚集现象，形成二聚体或多聚体，聚集后分子量变大，造成后续无法检测到条带或检出的条带位置不对。故膜蛋白样品不宜煮沸，建议根据蛋白具体属性在50-70 ℃ 左右进行热变性。还有一些对热特别敏感的蛋白，对热变性的温度有特殊要求，例如植物样品。植物中对热敏感的蛋白比较多，有的蛋白热变性温度需要与感受态转化温度（42 ℃）一样，过高则检测不到。总而言之，如果样品是膜蛋白，需要根据样品本身情况，谨慎调整热变性的温度，以提高检测效率。对于跨膜蛋白，常用可参考的变性温度是50-70℃ 15min或者 37℃ 30min。
跨膜蛋白实例详解
SLC16A3蛋白是一种单羧酸转运体4（MCT4）蛋白，大小为49kDa左右，它参与乳酸和其他小分子单羧酸物质的跨膜运输。这种蛋白在许多生理过程中发挥作用，包括能量代谢和pH调节。
上样量：20ug；SDS PAGE：10%；变性条件：37℃ 30min；转膜：湿转100V，120min。
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综上所述，成功的实验往往需要前期扎实的背景调研和细致的实验操作，预实验的重要性在于研究人员可以调整蛋白质抽提、电泳、转膜和免疫印迹等步骤，以优化实验条件并确定最适合的抗体浓度和工作条件，以便成功检测目标蛋白质。这有助于确保后续的实验数据得到正确解释，从而对研究结果的准确性和可靠性产生重要影响。
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