一、染色原理

1、嗜酸型&嗜碱性

易于被碱性或酸性染料着色的性质称为嗜碱性和嗜酸性;而对碱性染料和酸性染料亲和力都比较弱的现象称为中性。

1)嗜碱性

嗜碱性是指组织和细胞内酸性物质成分对碱性染料(含有阳离子着色基团的染料，如苏木精、结晶紫、美蓝等)具有亲和性。

在普通染色法中，染色液的酸碱度为pH6左右，细胞内的酸性物质如细胞核的染色质、腺细胞和神经细胞内的粗面内质网及透明软骨基质等均被碱性染料染色。

2)嗜酸型

组织细胞内碱性物质与酸性染料(如伊红)有亲和性，染色结果为红色。细胞质中的蛋白质如红细胞中的血红蛋白、嗜酸粒细胞的颗粒及胶原纤维和肌纤维等被酸性染料染色，这些物质称为嗜酸型。

2、苏木精&伊红

1)苏木精

由苏木中提取的一种酚类化合物。是细胞学中常用的染色剂，常与伊红合用。难溶于冷水和乙醚，易溶于热水和热乙醇，溶于碱、氨和硼砂的溶液。在分析化学中用于比色分析、显微镜分析，并用作pH值指示剂，变色范围5.0-6.0，由黄色变紫色。

苏木精为碱性染料，将细胞核染为蓝色;在水溶液中，特别是在碱溶液中易被空气氧化成红棕色的氧化苏木精。

2)伊红

伊红是一种化学合成的酸性染料，在水中解离成带负电荷的阴离子，可以和蛋白质氨基上带正电荷的阳离子结合，从而使细胞胞浆染成不同程度的红色或粉红色，与苏木素染色液染色形成的蓝色细胞核形成鲜明对比，从而使苏木素伊红染色成为病理组织切片中最广泛使用的一种常规染色方法。

伊红分水溶性的和醇溶性：水溶性伊红，易溶于水，溶液呈绿色荧光，能溶于醇。组织学用于上皮细胞、肌肉纤维和细胞浆染色。醇溶性伊红，能溶于碱，微溶于乙醇，不溶于水。吸附指示剂，检测F离子，定量分析滴定溴离子和碘离子。

3、细胞染色

1)细胞核染色

苏木精为碱性天然染料，可使细胞核着色。细胞核内染色质的成分主要是DNA，在DNA的双螺旋结构中，两条核苷酸链上的磷酸基向外，使DNA双螺旋的外侧带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精碱性染料以离子键或氢键结合而被染色。

由于组织或细胞的不同成分对苏木精的亲和力不同及染色性质不一样。经苏木精染色后，细胞核及钙盐粘液等呈蓝色，可用盐酸酒精分化和弱碱性溶液显蓝，如处理适宜，可使细胞核着清楚的深蓝色，胞浆等其它成分脱色。

2)细胞浆染色

细胞浆内主要成分是蛋白质，为两性化合物、细胞浆的染色与pH值有密切关系，当pH调到蛋白质等电点4.7-5.0时，胞浆对外不显电性，此时酸或碱性染料不易染色。当pH调到6.7-6.8时，大于蛋白质的等电点pH值，表现酸性电离，而带负电荷的阴离子，可被带正电荷的染料染色，现时胞核也被染色，核和胞浆难以区分。

二、染色程序

1、染色步骤

②脱蜡：将烤过后的切片迅速放入二甲苯中，2次，各5min。

③梯度水化：100%、90%、80%、70%的乙醇中各放置5min，蒸馏水放5min。

④核染：把水吸干，滴加苏木精染色液，染色5min，流水冲洗掉苏木素染液，显微镜观察染色程度。

⑤分化：1%盐酸酒精分化1-3s，水洗，浸入氨水中直至部分变成蓝色后，水洗;显微镜观察颜色，若颜色不够深可直接滴加苏木素染色液染色1min后，再次分化立即水洗;若过深则适当增加分化时间。

⑥复染：滴加0.5%伊红染液1滴，染色10-15s，蒸馏水清洗后显微镜观察。

⑦梯度脱水：80%、90%、95%和100%乙醇进行脱水。

⑧透明：浸入二甲苯2次，各5min，室温晾干。

⑨封片：滴加一滴中性树胶于组织上，盖玻片封片。24h后置于显微镜下观察拍照。

2、原理

1)分化作用

染色后，用某些特定的溶液将组织过多结合的染色剂脱去，这个过程称为分化作用，所用的溶液称为分化液。

在HE染色中用0.5%盐酸乙醇作为分化液，因酸能破坏苏木精的醌型结构，使组织与色素分离而褪色。经苏木精染色后，必须用0.5%盐酸乙醇分化，使细胞核过多结合的苏木精染料和细胞浆吸附的苏木精染料脱去，再进行伊红染色，才能保证细胞核与细胞浆染色的分明。因此，在HE染色中分化是极为关键的一步。

2)返蓝作用

分化之后，苏木精在酸性条件下处于红色离子状态，呈红色，在碱性条件下处于蓝色离子状态，呈蓝色。组织切片经0.5%盐酸乙醇分化后呈红色或粉红色，故分化之后，立即用水除去组织切片上的酸而终止分化，再用弱碱性水(0.2%氨水)使苏木精染上的细胞核呈现蓝色，这个过程称为返蓝作用或蓝化作用。

另外用自来水浸洗也可使细胞核返蓝，但所需时间较长。

3、试剂

①苏木精染液：称取苏木精粉0.5g，铵矾24g溶解于70ml蒸馏水中，然后取NaIO 31g，水5ml，再加入甘油30ml和冰醋酸2ml，混合均匀，滤纸过滤。

②伊红染液：称取0.5g水溶性伊红染液，溶于100ml蒸馏水中。或醇溶性伊红0.5 g，80%酒精100ml。

③1%盐酸酒精分化液：按体积比为浓盐酸：无水乙醇 = 1:99配制。

4、注意事项

①染色时调节pH值很重要。如果组织块在福尔马林中固定时间长， 组织酸化而影响细胞核着色。因此，要在自来水中冲洗时间长一些或在饱和碳酸锂水溶液中处理10-30min，这样可以使细胞核着色较深。染伊红时胞浆着色不佳，可在伊红溶液中滴加1-2滴冰醋酸。

②切片染苏木精后，分色这一步是关键，应在显微镜下控制进行，一般以细胞核染色清楚(晰)而细胞质基本无色为佳。如果过分延长分色时间将导致染色太浅，应重新染色后再行分色。

③切片经酒精脱水后，入二甲苯时可出现白色不透明状态，此为脱水不彻底，应将切片退回无水酒精，更换酒精、二甲苯，以求彻底脱水与透明。

④在染色过程中不要让切片干燥，以免切片收缩、变形，影响细胞形态。切片从二甲苯取出或进入二甲苯前，切片周边均应擦干净或吸干多余水分。

⑤最后封固时，要用中性树脂，防止日后褪色，盖片要选大于组织块的面积，如漏出一部分不久将会褪色，所用树脂浓度要适当，树脂封固时不能有气泡。

三、结果的判断和异常分析

1、实验结果

细胞核被苏木精染成鲜明的蓝色，软骨基质、钙盐颗粒呈深蓝色，粘液呈灰蓝色。细胞浆被伊红染成深浅不同的粉红色至桃红色，胞浆内嗜酸性颗粒呈反光强的鲜红色。胶原纤维呈淡粉红色，弹力纤维呈亮粉红色，红血球呈橘红色，蛋白性液体呈粉红色。

着色情况与组织或细胞的种类有关，也随其生活周期及病理变化而改变。例如，细胞在新生时期胞浆对伊红着色较淡或轻度嗜碱，当其衰老时或发生退行性变则呈现嗜伊红浓染。胶原纤维在老化和出现透明变性时，伊红着色由浅变深。

2、异常结果

①红蓝失调：若整体偏蓝，可能由于苏木素染色时间过长、分化不够，或伊红失效，伊红染色时间太短，分化过度;若整体偏红，可能由于苏木素染色时间不够，分化过度，脱蜡不充分，苏木素染不上，伊红染色时间过长，分化不够。可根据具体原因调整各步骤时间及更换试剂。

②HE染色后出现的大白色斑块或斑点：脱蜡不充分，可适当增加脱蜡时间以及更换新鲜的二甲苯。

③细胞核染色过浅：苏木素染色时间过短，或苏木素失效，或分化时间太长。可重新染色，将组织切片放入0.01%氢氧化钠、0.5%氨水、饱和的碳酸氢钠溶液、乙醇溶液，每个 3-5min，接着重新染色。可以适当增强组织的嗜碱性以增强核染色，如Zenker液固定的切片可放入5%碳酸氢钠溶液中3h，自来水冲洗5-10min染色，或Bouin液固定的切片可放入 5%碳酸氢钠溶液中1h，自来水冲洗10min染色。

④细胞核染色过深，胞浆着蓝色：苏木素染色时间过长，或切片太厚，或分化时间太短。这种情况首先镜下看看切片厚度(最佳厚度 1~2 层细胞核)，要么重新染色，要么重新制片。

⑤细胞核呈棕红色改变：苏木素染液失效;或苏木素染色后反蓝不足。应该立即更换苏木素染色液，或在流动自来水(pH7.5-7.8)，或在稀释的氨水溶液，或在0.2%碳酸氢钠中适当浸泡，这些步骤均可一定程度地加强苏木素染色后的反蓝效果。

⑥伊红染色较淡：伊红的pH发生了改变(pH可能已大于5)，或反蓝液体未漂洗干净，残留后影响胞浆嗜酸性染色，或者切片太薄并且在随后的脱水步骤停留过久。应检查伊红染色液pH，可使用乙酸调至4.6-5.0。根据具体原因，调整实验步骤。