一. 认识抗生素：

对抗细胞污染，相信大多数实验员都将希望寄托在抗生素身上，因为抗生素兼具了成本低廉、易操作、可控制等优点，已被证实是最可靠、有效的方法之一。

抗生素在细胞培养中的使用可以最大限度地降低由于污染导致的宝贵细胞、昂贵试剂以及较多时间的损失。经验丰富的研究人员建议在培养细胞时使用足够浓度的经过细胞培养测试的抗生素。例如青霉素-链霉素是青霉素和链霉素的混合物，广泛用于哺乳动物细胞培养基中，用以防止细菌污染。某些抗生素，如遗传霉素、潮霉素、杀稻瘟菌素、嘌呤霉素等，也用作选择剂，用于选择和建立转染/转基因的细胞。

二. 抗生素类型：

细胞培养常用的抗生素有青霉素、链霉素、庆大霉素、卡那霉素、四环素和红霉素等。我们熟知的双抗，即青霉素、链霉素混合溶液，常配制成100倍或200倍使用。

三. 常见抗生素及选用条件：

3.1 嘌呤霉素盐酸盐  Puromycin, Dihydrochloride  

嘌呤霉素(Puromycin)是一种氨基糖苷类抗生素，能有效抑制革兰氏阳性菌生长，还能抑制原生生物、藻类、哺乳动物和昆虫细胞的生长，一般2天内能杀死99%的细胞。其作用机制在于：嘌呤霉素是氨酰-tRNA分子3’末端的结构类似物，能够与核糖体的A位点结合并掺入到延伸肽链中，导致肽链合成的永久终止，进而阻止蛋白质合成。嘌呤霉素还具有抗肿瘤活性。作为蛋白合成抑制剂，用来研究细胞分化中控制基因顺序表达和协同表达的转录调控机制。

一般情况下，哺乳动物细胞建议工作液浓度1-10μg/ml，最佳浓度使用宿主细胞杀灭实验（杀灭曲线）来确定；大肠杆菌的LB琼脂培养基筛选敏感转化实验，建议工作液浓度为100-125μg/ml。使用嘌呤霉素筛选大肠杆菌阳性转化子不仅需精确的pH值调节，而且受宿主细胞本身状态影响。

3.2 盐酸万古霉素 Vancomycin Hydrochloride  

盐酸万古霉素(Vancomycin hydrochloride)是一种可在肽聚糖生物合成水平阻断细菌细胞壁生物合成的糖肽抗生素，为窄谱抗生素，仅对革兰氏阳性菌有效；是通过抑制易感细菌的细胞壁合成的第二阶段起作用，还可改变细胞膜的渗透性并选择性地抑制核糖核酸的合成。

3.3 氨苄青霉素钠  Ampicillin, Sodium Salt  

作为青霉素家族的一种β-内酰胺类抗生素，Ampicillin sodium能够渗透入革兰氏阳性菌和某些革兰氏阴性菌。Ampicillin是转肽酶的一种竞争性抑制剂，而转肽酶是细菌形成细胞壁所必需的。Ampicillin能够抑制细胞细胞壁形成过程中的第三步和最后一步从而最终导致细胞裂解。Ampicillin能够渗透入革兰氏阳性菌和某些革兰氏阴性菌。Ampicillin是转肽酶的一种竞争性抑制剂，而转肽酶是细菌形成细胞壁所必需的。Ampicillin 能够抑制细胞细胞壁形成过程中的第三步和最后一步从而最终导致细胞裂解。

3.4 硫酸博来霉素 Bleomycin sulfate  

硫酸博来霉素(Bleomycin Sulfate)是一类水溶性碱性糖肽类抗生素。主要抑制胸腺嘧啶核苷参入DNA，与DNA结合使之破坏分解，作用于增殖细胞周期的S期。是具有有效抗肿瘤活性的DNA合成抑制剂。可用于抗性筛选和诱导肺纤维化模型。

3.5 硫酸G-418抗菌素  G-418 Sulfate   

硫酸G-418抗菌素（遗传霉素）是一种氨基糖苷类抗生素，在分子遗传实验中，是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。G-418可以干扰80S核糖体的功能，并影响真核细胞中蛋白质的合成，主要用于哺乳动物、植物或酵母细胞的选择。G-418对细菌、酵母、高等植物、哺乳动物细胞、原虫和蠕虫均有毒性，其抗性基因为显性表型，在Tn601(903)和Tn5转座子上都有定位。G-418溶液经过滤除菌，一般工作浓度为50～1000ug/ml不等，不同类型的细胞需要根据实验确定最佳浓度。

一般来说，刚开始筛选转化子需要高浓度的G418，并用一个较低浓度的G418用于维持培养。生长条件，细胞类型和其他的环境因素都可能影响G418的用量，因此第一次使用的实验体系建议通过杀灭曲线(kill curve)，即剂量反应性曲线，来确定最佳筛选浓度。通常情况，哺乳动物细胞筛选范围200-2000μg/mL；植物细胞：10-100μg/mL；酵母细胞：500-1000μg/mL；网柄菌属：10-100μg/mL。

3.6 潮霉素B  Hygromycin B  

潮霉素B(Hygromycin B)，从吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)分离到的一种氨基糖苷类抗生素。通过与30S核糖体亚基结合，诱导对mRNA模板的错读且抑制易位，从而以阻止蛋白合成。潮霉素B能杀死细菌、真菌和高等真核细胞。主要用来筛选和维持培养稳定转染 Hph 载体的原核细胞或真核细胞（植物细胞和哺乳动物细胞）。

潮霉素B用来筛选稳定转染细胞株的工作浓度需要根据细胞类型、培养基、生长条件和细胞代谢率而变化。
✦ 哺乳动物细胞使用浓度：50-1000μg/mL，常用筛选浓度为200μg/mL，最佳浓度需要杀灭曲线来确定；
✦ 植物细胞常用浓度：20-200μg/mL；
✦ 细菌常用浓度：20-200μg/mL；
✦ 真菌常用浓度：200-1000μg/mL。

链脲菌素(Streptozocin)是一种广谱抗生素，具有抗菌、抗肿瘤的性能，能抑制肿瘤细胞DNA合成，并能抑制嘧啶核苷代谢和糖原异生的某些关键酶。在体内，链脲菌素能自发分解并产生引起DNA双链交联的甲基碳化离子，是一种DNA甲基化的诱导剂。还具有诱发糖尿病的作用，该药对动物的胰岛β细胞具有高度选择性的毒性作用，因其操作简单、成模快、模型稳定性好等优点，现已被广泛应用于糖尿病动物模型的构建。

四. 针对性：

抗生素也有适应症，有些抗生素抗菌谱广，但抗菌效力差（如四环素类）；有些抗菌谱窄，但抗菌效力强（如青霉素）。双抗主要针对革兰阳性菌、阴性菌有效。必须先明确是由哪种细菌引起的污染，然后再针对性选择能对抗此类细菌的抗生素，这样才能做到有效。

五. 抗生素的浓度：

抗生素浓度过低，则抑菌效果不佳，且耗时过长；浓度过高，虽然可杀死部分细菌，但会对细胞造成损伤。

六. 配伍：

单一抗生素有时候难以奏效，一般需要多种抗生素联合使用。

七. 抗生素使用注意事项：

日常培养中加入抗生素能在一定程度上抑制细菌的发生，但不排除会掩盖其他隐性污染，且不能百分百杜绝污染。

为了防止污染物继续扩散，最好的处理方式是丢弃！除非是有特别价值的细胞值得“抢救”，可尝试加大抗生素浓度，用大量PBS清洗去除微生物。

抗生素对培养细胞的形态和性状都有一定的影响。如果处理不好也有可能造成细胞的死亡。

反复使用抗生素会使微生物产生耐药性，且增加下游纯化难度。