qPCR(Quantitative Real-time qPCR)是实时荧光定量PCR的简称,是指使用实时荧光PCR仪,对整个PCR反应扩增过程进行实时的检测并记录其荧光信号。随着PCR反应的进行,荧光信号强度随着扩增产物的增加逐渐增强,通过荧光强度的实时监测,实现对目的基因进行定量分析。
做完qPCR,如何判断最后数据是否可靠,能不能用?要不要重新来?
这个问题对经常做的来说可能不是问题,但是对于新手来说是一个小问题。
一般来说,在qPCR数据分析中,判断数据是否可靠主要依据以下几个方面:
判断依据1,扩增曲线
扩增曲线(Amplification curve):在反应进行过程中,以循环数为横坐标,以反应过程中实时荧光强度为纵坐标,生成扩增曲线。
理论上PCR过程中反应产物是以指数增长的,但随着PCR循环数的增加,DNA聚合酶失活、dNTP和引物枯竭、反应副产物阻碍反应等原因,致使PCR的扩增效率降低,产物生成的速度逐渐减缓,因此扩增曲线是一条“S形”曲线。
扩增曲线可以分成四个时期:基线期,指数期,线性期,平台期。
基线期:扩增曲线的水平部分,扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖,无法判断产物生成量的变化。
指数期:PCR指数扩增期,扩增曲线起峰,每个循环的产物量与初始模板量符合指数关系,PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系。
线性期:PCR反应后期,由于PCR反应体系各成分的消耗、产物抑制等因素的影响,反应效率降低,产物量与初始模板量不再符合指数关系。
平台期:PCR反应停止,PCR产物不再随循环数增加而增加。由于影响PCR扩增的因素错综复杂,每个反应进入平台期的时间和平台期的高低都各不相同。
理想的扩增曲线应该呈现出典型的 S 型曲线,起始时没有扩增,起峰时间正常,并能达到平台期。且曲线应该平滑,没有明显的锯齿状。
判断依据2,Ct值在合理范围内
Ct值的定义:PCR过程中,扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。
Ct值是判断实验成功与否的重要参考。CT值应该在合理的范围内,一般来说,CT 值应该在 15-35 之间,且复孔间的曲线重复性好。
过大或者过小都不太好,过大可能是一些阴性扩增;过小则浓度过大,可对模板进行适当的稀释。
如果实验中使用了内参基因,内参基因一般小于20,并且样品间内参的Ct值差不超过1,表明内参基因表达量稳定。目的基因Ct值一般是大于内参基因Ct值。
判断依据3,溶解曲线
紧接着就要看溶解曲线了(一般通过熔解曲线判断扩增产物是否单一)。
熔解曲线(Melt curve)是以反应温度为横坐标,以荧光信号负一次导数(dR/dT)为纵坐标,反映温度与DNA双链解链程度变化的曲线。
熔解曲线是判断qPCR检测中是否具有非特异性扩增的重要指标。溶解曲线应该呈现单峰,峰的宽度较小,这表明扩增是具有特异性的。如果出现多个峰或非特异性扩增,数据可能不可用。
正常的溶解曲线TM(DNA双链解链50%的温度)在75-90之间,有一个平滑尖锐的单峰,无杂峰,如果峰距在5个TM内就更好了。如果溶解曲线不对,那么Ct再好都要重来。
熔解曲线主峰前有杂峰,可能原因:存在比目的片段短的非特异性片段,也有引物二聚体的可能,此种情况下可尝试提高退火温度、降低引物浓度、重新设计引物等方法解决。
熔解曲线主峰后有杂峰,可能原因:大多由非特异性扩增引起,存在比目的片段长的非特异性片段。可通过调整稀释倍数、减少引物等来进行调整。
判断依据4,标准曲线
通常用标准品按照倍比稀释成至少5个浓度梯度,以起始拷贝数为横坐标,以Ct值为纵坐标,生成标准曲线,建立Ct值和拷贝数之间的线性关系。
标准曲线的线性范围应当涵盖所有实验样本的浓度范围。标准曲线的R²值应接近1,通常要求R² ≥ 0.99。
根据标准曲线的一些参数可以判断荧光定量 PCR 体系的优劣。
斜率:标准曲线的斜率代表荧光定量 PCR的扩增效率,理论值为-3.32,表示扩增效率为100%,PCR产物的量在每个循环增加一倍。
扩增效率低于100%,其原因可能是PCR反应性能较差,包括引物、试剂和反应条件等不适宜,也可能是标准品稀释不准确。
扩增效率高于100%,表明反应体系中可能存在抑制因素,主要包括模板质量较差,模板浓度过高等。有时非特异性扩增也会导致PCR扩增效率过高,需要通过熔解曲线进一步验证分析。
PCR反应中并不是每个循环中的模板均能实现了完美倍增,一般PCR扩增效率在90%~110%之间(即每个循环的扩增倍数应在1.8到2.2之间,对应斜率范围-3.58~-3.10),都可以用于数据分析哦。
如果 qPCR 数据满足以上要求,则一般可以认为数据可用。如果数据存在异常或不符合要求,则需要进一步分析原因并采取相应的措施,如优化实验条件、重新实验等。
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