养过细胞的小伙伴们一定常常遇到各种各样的细胞污染情况，比如细菌污染、真菌污染、病毒污染、支原体污染等等，其中支原体污染是最难以辨别、难以去除的一种污染，本文将为你全面总结支原体污染的知识点。

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什么是支原体？

在细胞培养过程中，支原体感染发生率达到63%，而且，当细胞被支原体污染后，往往无明显形态变化，培养基不浑浊不变色，令人难以察觉，等发现端倪时细胞已传了很多代，因此支原体污染已成为细胞培养的一大难题。

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细胞是怎样被支原体污染的？

细胞主要通过以下几种途径被支原体污染：

1. 1.      细胞之间交叉污染。
2. 2.      细胞培养操作人员的口腔、皮肤等。实验室的工作人员是口腔支原体、发酵支原体和人型支原体的主要来源。
3. 3.      工作环境或实验器材的污染。在超净台中，用胰蛋白酶消化污染的细胞后发现，活的支原体可从细胞培养瓶外的细胞计数板、移液器、废弃盘中被技术员分离出来。即使过了四至六天，活的支原体仍然可以存在于超净台表面，可被成功恢复。
4. 4.      培养基的污染。精氨酸支原体和无胆甾支原体来自胎牛血清和新生牛血清。胰酶如果是猪来源的，那么也可能存在猪鼻支原体。

5. 5.      不恰当的灭菌。高压锅或干热烤箱中堆积太多的物品造成加热不均，使一小部分耗材未得到消毒。灭菌循环时间过短也是另一个灭菌不彻底的操作。

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怎样判断细胞被支原体污染？

1. 1.      增殖减慢、状态变差、细胞边界变得模糊；
2. 2.      上清液澄澈；
3. 3.      背景干净；
4. 4.      细胞形态异常（拉丝、铺展）（图2）；
5. 5.      更换新的培养液细胞状态没有恢复。

1. 1.      微生物培养法

将样品培养在特殊琼脂培养基上，在37ºC有氧环境中孵育2周，阳性培养基上会长出100~400um大小的“煎蛋状”菌落

1. 2.      DNA荧光染色法

支原体DNA中A-T含量占多数（55～80%），容易被Hoechst 33258此荧光剂染上，被支原体污染之细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一的荧光小点

1. 3.      ELISA法

将支原体16S核糖体RNA标上标签，然后用特定抗体预包被过的微孔板对标签进行捕获，再加入显色用的抗体及底物，最后通过比色法得出检测结果。

1. 4.      PCR法

原理为扩增支原体16S核糖体RNA的基因，能检测多达19种支原体，操作快速、准确性高，市面上有多款相关产品可参考。

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如何去除支原体？

对于较为重要的细胞可以采用以下的方法。

1. 1.      清洗纯化法

细胞营养驯化→优质细胞群的筛选→细胞清洗→反复离心洗涤，其原理是利用离心力、细胞、微生物质量和悬液的浮力差达到清除支原体的目的。由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生,所以通过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低至极限。

如结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到更好的效果。支原体最突出的结构特征是没有细胞壁，因此，对作用于细胞壁生物合成的抗生素，如内酰胺类、万古霉素等完全不敏感；对多粘菌、利福平、磺胺药物普遍耐药。大环内酯、四环素和喹诺酮三类抗生素，是公认对抗支原体效果最佳的药物。

1. 2.      用MRA处理

用支原体清除剂（Mycoplasma Removal Agent）处理细胞，作用浓度为 25μg/ml，两周可以清除支原体。

1. 3.      药物辅助加温处理

先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在41℃培养18小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。

1. 4.      使用支原体清除培养基

每2-3天更换1次新鲜培养液，换液时用无菌平衡盐溶液洗涤细胞1-2次；期间如果细胞密度过大，保持细胞密度适当，并更换新的培养器皿，3天之后，即可见明显清除效果；处理15天后，可以用支原体检测试剂盒进行检测，检测支原体是否杀灭完全；如果仍有支原体残留，可以考虑再处理6天；为避免细胞再次受到“支原体”的污染，以后每隔1个月进行支原体的常规检测，以保证没有新的支原体污染。

1. 5.      使用支原体特异性血清

用5%的兔支原体免疫血清可去除支原体污染，因特异抗体可抑制支原体生长，故经抗血清处理后11天即转为阴性，并且5个月后仍为阴性。

1. 6.      动物体内接种除菌法

把受支原体污染的肿瘤细胞接种在同种动物皮下或腹腔中，借动物免疫系统消灭支原体，而肿瘤细胞却能在体内继续生长，待一定时间后，从体内取出细胞再进行培养繁殖。

1. 7.      巨噬细胞吞噬法

从动物腹腔采取巨噬细胞，为排除其它细胞成分，可先进行纯化，然后再加入被支原体污染的细胞培养液中混合培养。在培养过程中，为检查支原体是否已被消除干净，可利用支持物培养法验证，取出支持物逐日染色、镜检观察，至支原体已被消除干净为止。

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如何预防支原体污染？

1. 1.      新购产品检测

新到的细胞、培养基、血清都可以做一下简单的污染检测后再开始实验。另外要注意每次试剂量配制不宜过多，建议分装使用，分装时用针头滤器过滤一次。

1. 2.      控制环境污染

要保证实验室和培养箱的洁净，按时杀菌，可以用酒精擦拭和紫外照射的方法。必要时可以通臭氧过夜。

1. 3.      严格无菌操作

进行实验操作时一定要按照实验室的要求，确保无菌操作。感冒咳嗽时尽量不要使用细胞房，如果必须使用，请在实验后彻底清洁消毒使用空间。准备好细胞房专业洁净衣，戴好口罩和手套。

所有进超净台的物品最好都用酒精擦拭一遍，超净台里面的东西一定要尽量少放，东西太多会影响超净台内空气流通及空气除菌细胞培养基和器材要保证无菌;

1. 4.      最小化抗生素使用频率

非珍贵细胞污染直接丢弃，避免抗生素滥用导致抗药性产生。

结语

掌握识别支原体污染的方法对于细胞培养至关重要，建立支原体早期检测及后期无菌操作的意识可以有效降低支原体污染的风险哦！