【前言】
早期，人们就发现在细胞的生命活动中，DNA复制、mRNA转录与修饰以及病毒的感染等，都涉及基因-蛋白质相互作用，很多生理学家都探讨了这种现象的发生过程。
近年来，随着研究的深入，很多医学研究者已经将目光投向了基因-蛋白相互作用，期望在此水平上，另辟蹊径，深入分析癌症、心血管疾病、中央神经系统紊乱等疾病的主要代谢通路和发生机制。
染色质免疫共沉淀（ChIP）作为目前为止唯一的研究体内DNA与蛋白质相互作用的实验方法，深得人心。很多人都希望接触和掌握此实验技术，希望从组蛋白修饰、转录调控、凋亡等角度深入研究病变机制，进而开发相应的药物。
总之，ChIP是一个有效且重要的实验技术。下面就来聊聊它。
【正文】
能够与DNA结合的蛋白有多种，主要分为组蛋白和非组蛋白。
一方面，染色体是由组蛋白和DNA构成的，组蛋白作为染色体的结构蛋白，可以与DNA形成核小体，组蛋白与DNA的结合关系是固定存在的，因此组蛋白的修饰作用成为研究的关键。NaCl可解除组蛋白和DNA的交联关系。
另一方面，非组蛋白多是参与DNA复制、mRNA转录过程的一些功能蛋白，包括解链酶、切割酶、转录激活蛋白等等，它们与DNA、mRNA的结合关系是瞬时的，发挥完作用可能就及时脱离开了。
ChIP实验原理：在活细胞状态下，通过甲醛固定DNA-蛋白质复合物后，采用微球菌核酸酶（Micrococcal Nucleas）（注：早期使用的超声已经被淘汰了，不推荐使用）随机切断DNA，形成一个个一定长度范围内的染色质小片段，随后通过抗原-抗体特异性结合反应富集、沉淀这些小片段，然后通过对NaC、蛋白酶K解除蛋白质和DNA的交联，分离蛋白，纯化DNA，最后采用PCR检测DNA的序列信息，获取更多信息。
从上面的原理就可以看出，ChIP实验步骤大致可分5步：
（1）1%甲醛处理使蛋白质与 DNA 交联 ；
（2）细胞裂解，采用微球菌核酸酶消化形成染色质小片段；
（3）抗原-抗体反应，促进免疫沉淀反应；
（4）NaCl、蛋白酶 K 处理，解除DNA-蛋白交联；
（5）DNA 纯化回收；
（6）采用1.8%琼脂糖凝胶电泳、RT-PCR对DNA作进一步分析。
因各试剂商提供的ChIP试剂盒操作参差不齐，因此实验的具体步骤不再展开，大家只需要按照手头上的试剂盒操作说明严格操作即可，但是核心步骤基本符合。接下来的内容主要是注意事项。
注意事项
想要做好ChIP实验，必须要控制好6个方面，包括培养基内活细胞数量、交联时间长短、消化后的片段大小、抗体的种类和特异性、常规实验操作技术等多种因素影响 。想要控制这些过程，最核心的就是全面设置对照组。下面逐个做说明。
1. 活细胞数量
活细胞计数后，如果最终用于ChIP实验的细胞数量太高，将直接导致甲醛交联时间增加，间接导致细胞数量/微球菌核酸酶比例增大，这些均可造成裂解的DNA小片段过长（超过1000bp），实验处理过程中极易丢失这些片段，最终也会造成PCR检测困难或失败。最佳的DNA片段长度是150bp-300bp。相反，如果过细胞数量太少，则导致细胞数量/微球菌核酸酶比例减小，最终得到的DNA片段极可能小于100bp。
总之，你所研究的DNA-蛋白丰度直接决定了ChIP实验所需的细胞数量，没有固定的数量标准，这些都需要预实验充分摸索。
2. 甲醛交联时间
1%终浓度的甲醛交联时间推荐5-6分钟。时间过久，会造成裂解的DNA小片段过长（超过1000bp）。时间太短，会导致交联不完全，实验过程中导致一部分的DNA-蛋白质复合物分离，最终分析的结果必然是不准确的。
3. 设置对照组
ChIP实验内对照：染色质断裂后，须按一定比例留取部分染色质溶液，此Input DNA（断裂后的基因组DNA）作为ChIP实验的内对照。内对照不仅可以验证染色质断裂的效果。如果按照取样比例换算，还可以根据Input DNA中靶序列的含量和染色质沉淀中的靶序列含量，推算ChIP实验效率，所以Input内对照是必须要设置的。
阳性抗体对照：目的抗体沉淀DNA-蛋白复合物时，必须需设置阳性抗体对照组。阳性抗体通常选择与已知序列相结合的、各物种之间比较保守的蛋白抗体，常用组蛋白抗体。
抗体阴性对照：目的抗体沉淀蛋白DNA复合物时，必须需设置阴性抗体对照组。阴性对照所使用的抗体可以选择目的蛋白抗体宿主的血清蛋白。
4. 目标蛋白抗体
ChIP实验中与一般的抗原-抗体免疫反应实验不太一样。
常规实验如western blot、蛋白质免疫共沉淀等，抗原上只要存在与抗体结合的位点，则二者的免疫反应基本不受到蛋白质空间结构影响。（参见往期内容：①.全程剖析Western blot原理，你才能掌控它。② Co-IP免疫共沉淀）
ChIP实验中，染色质沉淀步骤时，蛋白和DNA处在交联状态，目标蛋白的结合位点形成空间阻碍，导致抗体无法与目标蛋白结合形成复合物。因此，能力够做western blot、蛋白质免疫共沉淀实验的抗体不一定能够做ChIP实验，一定一定要使用已经过ChIP验证的抗体，否则实验必然失败。此外，抗体的浓度、孵育时间、孵育温度需要根据目标蛋白的丰度决定。目标蛋白丰度较低时，可能需要调整活细胞数量、过夜4℃孵育等。
进一步，内对照组、阴性抗体对照组、阳性抗体对照组的纯化DNA先采用PCR扩增，随后通过1.8%琼脂糖凝胶电泳，得到的结果应该是这样的：空白对照组无条带、阴性抗体对照组条带若或无、内对照组强条带、阳性对照组看到强条带。只有这样的结果才是成功的。后续才能进行RT-PCR实验。
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