WB检测蛋白质磷酸化的原理：

蛋白质免疫印迹法（WB）是定性检测蛋白质磷酸化水平的金标准。通过SDS-PAGE分离蛋白质后，当施加电压时，蛋白质从凝胶转移到膜上（常用PVDF膜、NC膜或尼龙膜）。用能够识别目标蛋白质磷酸化的抗体孵育膜，然后用辣根过氧化物酶 （HRP） 偶联的二抗孵育。当添加HRP底物时，可以检测到抗体结合了磷酸化的蛋白质，从而产生化学发光。

蛋白质印迹的灵敏度和特异性取决于所使用的抗体。如果抗体与样品中的其他蛋白质非特异性结合，则与蛋白质分子量标准相比，蛋白质的分子量和迁移模式通常有助于确定哪个条带是目标蛋白。然而，如果抗体与具有相似重量的多种蛋白质亚型结合，这可能会有问题。因此，磷酸化蛋白的迁移可能与预期不同。

通过肉眼比较不同样品免疫印迹处理的条带强度的相对差异，但可以提取密度测量信号以获得半定量数据。基于荧光的蛋白质印迹使用荧光偶联检测抗体，是定量分析和同时检测多种蛋白质的首选方法。采用蛋白质印迹法的磷酸化研究应至少包括管家基因、磷酸化蛋白和总蛋白的表达水平分析。

磷酸化的抗体是怎么制备的？

磷酸化抗体是针对磷酸化位点制备的，识别的是磷酸化的氨基酸，从而能够检测蛋白质的磷酸化水平，并且只能识别磷酸化的蛋白，而不能识别非磷酸化的蛋白。

磷酸化抗体的制备原理是先体外合成磷酸化修饰的多肽抗原，一般小于15个氨基酸，纯度大于90%。然后免疫小鼠或兔子，后续步骤同常规抗体的制备方法。

注意合成肽免疫制备抗体需要偶联KLH,BSA或OVA等载体蛋白以提高免疫原性。

WB检测蛋白质磷酸化注意事项：

（1）需要设置阴性对照和阳性对照。

设置阴性对照可以和实验组很好的从迁移率（分子量）上区分非磷酸化的和磷酸化的蛋白质。阳性对照则可以比较不同实验组条件对蛋白质磷酸化水平的影响有无差异。

（2）选择合适的磷酸化抗体

首先要区分非磷酸化的抗体和磷酸化的抗体。一般原则是非磷酸化的抗体既可以识别非磷酸化的蛋白，也可以识别磷酸化的蛋白。磷酸化的抗体只能识别磷酸化的蛋白，而不能识别非磷酸化的蛋白。当然由于抗体识别表位的原因，不排除有些非磷酸化的抗体只能识别非磷酸化的蛋白，不能识别磷酸化的蛋白。

其次要选择对应的磷酸化位点的抗体。

因此在选择磷酸化抗体之前，一定要先查阅文献在你的实验条件下或者预测目的蛋白是发生哪种位点的磷酸化，或者根据磷酸激酶来判断可能的磷酸化位点。

（3）蛋白质迁移率变慢或者分子量变大，不一定是磷酸化。

通常认为在非磷酸化的蛋白条带以上的条带（相隔距离很近）是磷酸化的。相隔距离很远的，肯定不是磷酸化的（至少不是单纯磷酸化的，有可能是磷酸化之后又被其他修饰的）

（4）WB分析磷酸化蛋白时需要注意什么？

尽量降低二抗的浓度。使用浓度过高的二抗可能导致与目标蛋白以外的蛋白质的非特异性结合。任何蛋白质都可能发生非特异性结合从而导致更高和更低分子量的条带出现。推荐使用1：5000-1：20000范围内的二抗稀释度。同时可以设置一个对照，就是不孵一抗，只孵二抗的对照组，从而确保抗体的特异性。

（5）WB检测磷酸化蛋白时，BSA的封闭效果比脱脂牛奶好

脱脂奶粉中含有大量的酪蛋白，是一种磷酸化蛋白，如果要WB检测磷酸化蛋白的话，就最好别用脱脂奶，否则会产生高背景。