MEM、DMEM、IMEM、1640，培养基眼花缭乱？支原体、黑胶虫、真菌、细菌，细胞污染千奇百怪？复苏、传代、冻存、慢冻速溶，步骤繁琐？看完本文，你就是养细胞全能选手！01 新买的细胞拿到手，应该怎样做？收到新的细胞后，先拍照并观察培养基颜色是否澄清以及是否存在漏液的情况，确认无问题后，不要急于打开盖子，用酒精消毒整个细胞外瓶，放在培养箱静置若干小时（视细胞密度而定），取出在倒置显微镜下观察细胞生长情况，并在不同倍数下拍照，排除细胞本身污染的情况。

02 细胞复苏、冻存步骤和注意事项？

注意事项：1）复苏解冻细胞时，水浴锅一定要提前调到37℃，不要等到取出细胞再打开水浴锅！小心晃动细胞，不要让水进入冻存管内造成污染。如果水浴时间大于2min冻存液还没融化，可以将水浴锅温度调至40℃左右，缩短解冻时间。2）冻存细胞时，冻存管的盖子一定要拧紧，防止渗水造成细胞污染，必要时可以用封口膜缠绕。记得做好标记（细胞名称、冻存时间、冻存人姓名等），记录存放位置，方便之后取用。3）冻存细胞一定要梯度降温！有几种方式：① 冻存管放入 4℃，约 30 min,转入﹣20℃ 30 min~60 min，细胞悬液结冻后，放入 -80 ℃ 冰箱，过夜，之后转入于液氮罐中。② 将冻存管放于程序降温盒中，并置于 -80℃ 冰箱 4 h 以上，转入液氮罐中长期保存。注意及时补充液氮，确保细胞浸在液面下。

03 悬浮细胞和贴壁细胞怎样传代？细胞密度生长到70%-80%时即可进行传代。悬浮细胞传代可加入等量新鲜培养基后，直接吹打分散进行传代，或用离心法后，加入新培养基后再吹打分散进行传代。贴壁细胞需要消化下来进行传代。一般使用0.25%或0.05%胰酶。胰酶拿到手时是存放在–20°C的，放在4°C解冻后，少量分装于无菌试管中，保存于 –20°C，每次用的时候拿出分装解冻，否则反复冻融会导致胰酶活性降低。胰酶浓度和消化时间可以直接请教养过这种细胞的师兄师姐，如果是新的细胞，建议先用低浓度的胰酶摸索消化时间，每隔 1min镜下观察细胞是否变圆，等细胞间隙明显，部分细胞刚开始脱离瓶壁时，加入完全培养液（含有FBS）混匀终止消化。记得标记细胞名称、传代时间、代数、盘数、操作人员等信息！

04 常用的培养基有哪些？

DEM、DMEM、Ham's F-12、DMEM/F12、RPMI-1640、IMDM、M199 Medium

05 细胞状态不好，养不起来怎么办?检查培养基是否使用合适。可以提高血清浓度到 15%～20%，48 h后再换成正常 10% 的浓度。或者更换品质更好的血清。可以适度提高细胞密度，从培养瓶换到六孔板，12 孔板等等，细胞密度大，细胞分泌的细胞因子多，肿瘤细胞通过旁分泌途径促进细胞生长。有可能是细胞传代次数过多，细胞老化或胰酶消化过度，导致细胞状态不佳及胞质疏松。所以一定要控制细胞传代次数，缩短胰酶消化时间。细胞存在污染（详见10~13）

06 怎样区分活细胞和死细胞？可以通过在显微镜下观察辨别，活细胞中间透亮，饱满，有光泽，死细胞较暗。可以通过台盼蓝染色来计算细胞活力。用无血清培养基把细胞悬液稀释到 200～2000 个/毫升，在 0.1 毫升的细胞悬液中加入 0.1 毫升的 0.4% 的台盼蓝溶液。轻轻混匀，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼蓝，因而染成蓝色的细胞是死细胞，注意计数需在加入台盼蓝 10 min 内完成。有细胞计数仪的，可直接用计数仪进行计数。

08 细胞抱团怎么处理？一些悬浮细胞抱团生长是正常现象。大部分悬浮细胞在细胞密度很高的情况下，很可能会出现部分细胞抱团生长的现象，但是聚团细胞很容易死亡并演化成絮状物，殃及周围的悬浮细胞，因此在培养悬浮细胞时需控制好细胞密度。对于较大的细胞团可以将细胞悬液收集到15 ml离心管中，静置20 min左右，小心取上层细胞上清培养。另外，也可以通过细胞筛去掉部分较大的细胞团。

09 细胞不贴壁是什么原因？1）细胞传代时胰酶处理太久，造成细胞膜蛋白损伤，使细胞贴壁不紧，显微镜下观察立体感不强，严重的时候甚至会造成细胞死亡。因此要缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。2）培养基中缺少贴壁因子。无血清培养基工艺中由于缺少这种促贴壁因子，细胞的贴壁效果会下降很多。可以更换血清。3）培养液配置、储存不当，如 pH 值过碱，Gln 量太少等原因。可以使用无菌醋酸溶液调整 pH 值或充入无菌 CO2。4）复苏的细胞本身状态不好，已经老化，失去贴附性。可以启用新的保种细胞。如果细胞比较珍贵或没有备份细胞，可以尝试将不贴壁细胞收集离心，再用 PBS 清洗一遍，离心后的沉淀加入胰酶重新消化接种，同时提高血清浓度到 15%~20%。5）细胞污染（详见10~13）

10细菌污染表现：细菌污染时细胞培养基可能在几个小时呈现混浊，爆发很快。有时稍加震荡，便会有很多混浊物漂起（图3），普通倒置显微镜下呈黑色细沙状（图4）。

对策：可在培养液中加相应的抗生素处理，如用四环素，庆大霉素，或者链霉素，前两者的工作浓度是50 μg/mL; 链霉素的工作浓度是100 μg/mL。但是，细胞本身也会受到影响，状态大不如从前，所以，正确操作、严格执行无菌操作规范、定期清理消毒培养设施，防范于未然才是关键!

11真菌污染表现：常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、白色念珠菌和酵母菌。真菌污染最短3天才能长出椭圆形的霉斑。真菌污染后，细胞生长变慢，真菌生长的比较慢，不那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活。培养液一般仍然清亮，在显微镜下可以观察到各种形状的菌丝（图5、图6）。念珠菌和酵母菌则会呈卵圆形散在细胞周边和细胞之间。

对策：立即扔掉，然后彻底消毒灭菌培养间、孵箱、器皿和培养液。用硫酸铜溶液擦拭CO₂孵箱，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜，可以防止霉菌污染。

12支原体污染表现：支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是细胞状态变差、生长变慢，在显微镜下观察可能会有小黑点。细胞空泡化，存在很多类似凋亡、坏死的细胞，最终细胞漂浮，完全死亡。检测支原体污染的可靠方法是通过使用荧光染色（例如Hoechst33258染色）、ELISA、PCR、免疫染色、放射自显影或微生物测定法定期检测培养物。（图7）

对策：支原体是牛血清中最常见的微生物之一，且它不能用过滤的办法除去。建议直接扔掉。如果是珍贵的细胞，建议使用专用的支原体清除培养基。

13黑胶虫污染“黑胶虫”及其分解复合物是一种常见的细胞污染物，与细胞共生，随细胞传代而传代，通常抗生素对其无效。“黑胶虫”与细胞竞争性生长，对细胞生长不利，严重时导致细胞死亡。不过学术界对于“黑胶虫”的定义一直存在争议，黑胶虫究竟是一种生物还是非生物？有人认为是从血清中来的一种原虫，也有人认为是细菌，或是真菌，也有人认为是血清中的蛋白的结晶。表现：培养液不浑浊，但在显微镜下观察细胞时，细胞周围和培养液中有很多“小黑点”，且随着培养时间的延长，“小黑点”逐渐增多，存在布朗运动，更换培养液或洗涤细胞不能将其去除；细胞生长缓慢，细胞状态差，空泡化严重，甚至还可能出现细胞形态的改变

对策：1.最直接的办法：换好一点的血清。2.可用无菌的PBS洗几次，可一定程度上缓解。3.换用进口的一次性塑料培养瓶，保证培养环境和细胞间的洁净程度。

14交叉污染表现：虽然不如微生物污染普遍，但许多细胞系与HeLa以及其他快速生长细胞系之间的广泛交叉污染已经是一个明确的问题，会产生严重的后果。对策：在进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分。在进行换液或传代操作时，注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口，以免把细胞带到培养液中污染其他细胞。