01

石蜡切片

制作流程：较复杂    

耗时：长    

优点：制片量大，蜡块易保存    

缺点：效果受组织本身性质影响，总体效果一般。

一般制作流程分为孵育一抗和孵育二抗：

组织处理：取材→固定组织（一般选用4%多聚甲醛，固定24h）→冲洗（流水6~8h）→脱水（依组织本身特性决定所需脱水时间）→包埋→切片

孵育一抗：切片复水→冲洗（2~3min）→热修复（枸缘酸钠溶液）→冷却至室温→PBS洗涤（3次每次5min）→划线（利用组化笔)→山羊血清封闭40min→准备一抗（抗体：稀释液比例1：200，在山羊血清封闭期间进行）→封闭完不用冲洗，多余液体甩去→加配置好的一抗（需完全覆盖组织）→4℃冰箱孵育盒孵育过夜（孵育盒提前放置一些PBS溶液防止蒸发）

孵育二抗：冰箱取出复温2h→PBS洗涤（3次每次5min）→配置二抗（1:400）→37℃孵育2h→PBS洗涤（3次每次5min）→用含DAPI的封片剂封片→镜检

注意：1、热修复可以选用微波炉或者高压锅，推荐使用高压锅。条件：沸腾后2min

2、二抗配置及以后操作均需要避光操作

3、根据一抗属性和封闭所选用的山羊血清，二抗采用山羊抗兔，稀释比例按说明书进行。

02

冷冻切片

制作流程：较简单

耗时：较短

优点：制片效果好，组织完整，特异性较明显

缺点：操作要求高，特殊组织需用到液氮，较昂贵

一般制作流程同石蜡切片相近也需要孵育一抗和二抗：

组织处理：取材→固定组织（一般选用4%多聚甲醛，固定24h）→蔗糖脱水（一般选用15%和30%蔗糖梯度脱水即可）→Oct包埋→冷冻切片

孵育一抗：切片固定15min（4%多聚甲醛）→PBS洗涤(3次每次5min)→划线（利用组化笔)→山羊血清封闭30min→后续操作同上

孵育二抗：同上

注：个别特殊组织如雄鼠睾丸等制作冷冻切片时利用液氮极速凝固效果更好，常规冷冻凝固这类组织可能会出现冰晶。

总结：如图A和图B，可以很明显的看到，石蜡切片在经历一系列热修复等操作后对卵巢组织有一定破坏，组织结构会变的松散。相对B图冷冻切片则卵巢组织结构完好；在特异度方面冷冻切片效果也更加明显。但是就像之前介绍石蜡切片时我说的，石蜡切片做的荧光效果易受组织本身性质影响，这种出现的组织结构松散并不一定会在其他组织体现，如图C。