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如何铺出漂亮的细胞板?铺板成功的关键在于?
阅读:257次 | 来源:医学科研小坑 | 2024/1/19 11:34:18

细胞铺板时,常出现的细胞分布不均匀现象。

铺板成功的关键在于(1)细胞一定要消化好!!(2)铺板前要混匀!把可能的细胞团尽可能分开!!

细胞铺板实验

主要分为3大步骤:收集细胞→细胞计数→细胞铺板。

一、收集细胞,制作单细胞悬液

这里需注意:


  • 消化细胞需要选择适用的消化液、适当的消化温度和时间。建议新手或者养的是一个新细胞时,自己要观察最佳胰酶消化时间及浓度。


  • 消化后需要轻轻拍打细胞贴壁面,震落细胞。


  • 一般用1000rpm/min离心即可,离心力太大细胞容易抱团!


  • 离心后,要充分悬浮!悬浮离心后的细胞团时,先不要把所有液体都加进去!一般先加2mL液体,然后用1mL移液器轻轻将细胞吹起(注意不要有气泡),细胞要像云雾一样散开,这样易于形成单细胞。此外,吹散次数过多也会影响细胞活力,所以要熟练操作,尽快上板。

二、细胞计数

取10 微升加4%台盼蓝计数活细胞。

三、细胞接种

需要根据实验目的选择不同规格的培养板。

① 稀释细胞:根据细胞计数结果后,将细胞稀释到目的浓度。

获得细胞悬液后要先根据选择的培养板的种类,以及要种的细胞密度调整细胞悬液的浓度,可在离心管中调整后反复颠倒摇匀,种板需要一步完成,切不可先加细胞后补液或先加液再补细胞。

tip:细胞密度对于铺板很重要,过密很容易造成细胞居中,细胞浓度过稀会造成细胞难以生长起来。

② 加入细胞悬液

(1)铺6孔板,12孔板或24孔板

为防止表面张力导致的中间液面太低细胞聚集的现象,通常在每一个孔加少量的无血清培养基,不用太多,浸润孔底即可。一般可加一个孔,浸润,再用移液枪移取,再加入第二个孔,浸润,依此类推。

如果培养液量少,由于瓶体内液体有向边缘吸的特性,所以造成中间低洼,细胞容易聚集,可以多加点液体缓解。

然后加入细胞悬液,从孔的左边靠近底部贴壁慢慢加入,这样加液后,细胞悬液会平铺在整个孔底,细胞分散较均匀,可以避免加在中间位置和加在周边晃匀后周边细胞局部太多的现象。

细胞悬液加完后,将细胞培养板抬高,对着灯光,从底部往上看,看细胞有没有抱团。如果有抱团的话,用手指从底部轻轻敲打,使之分散。

接下来,将板放在水平板面上“十字”形摇匀(上下左右四个方向进行移动,呈十字形状,重复5-6次),这一步很重要!不可以转圈摇,因为细胞会被带到中间。摇匀后要放工作台静置一下,等细胞贴壁了,轻轻移入到培养箱中。

(2)铺96孔板

可用排枪,每孔加入100微升细胞悬液,从孔的左边靠近底部缓慢加入(加样过快容易导致细胞聚集)。加完半边板48孔后,将剩下的未加的细胞悬液再混一下,再继续加剩余的半边板子。

加完所有的时候,盖上盖子,左手轻轻扶住板的左边,右手轻轻敲击板的右边缘,注意把握力度,敲三次即可,太大力或次数太多会导致细胞集中成堆。将板顺时针旋转(逆时针效果不好),依次敲击剩余三个边,然后静置约5min,放置培养箱。

注意事项:

★ 用排枪吸取时,一定要保证每个枪头吸上来的悬液体积一致。
★ 如果是用于进行MTS等长时间测试时,最外圈应空余出来(中间60孔为最佳),加入PBS或细胞悬液(做空白或阴性对照),以防止培养基蒸发引起的边缘效应。

培养箱里面或者外面尽量不要放可以产生振动的仪器,比如离心机、涡旋器一类的仪器。

#细胞铺板不匀解决策略#

铺板不匀解决策略:

第一:对于96孔板,每孔通常加入100μL细胞悬液。加样方式为倾斜枪头,从孔的左边靠近底部缓慢加入(加样过快同样容易导致细胞聚集)。笔者建议,每加完半拉板子时,把细胞重新混匀,继续加样。加样结束后,镜下观察如有局部不均匀现象,可以采取敲击法,具体操作如下:将板子置于台面上,左手持住板子的左边,右手轻轻敲击板子的右边缘(5-8次),力度太强或次数太多会反而更易导致细胞聚集。将板子顺时针旋转,依次敲击剩余三个边(据说逆时针效果不好),静置约5-10分钟后,放入37℃培养箱。

对于6孔板、12孔板或24孔板,为防止表面张力导致的中间液面太低细胞聚集的现象。通常每孔首先滴加少量培基,轻轻晃动浸润整个孔底以保证板子的孔底都是湿润的,这样加液后细胞悬液会平铺在整个孔底,可以避免加在中间位置和加在周边晃匀后周边细胞局部太多的现象,细胞分散会较均匀。注意加完细胞悬液后要放工作台静置一下(5-10分钟)。镜下观察细胞均匀度,如不均匀可采用以下8字法、十字法及震荡法等方法进行细胞均匀度处理。具体操作如下:

第二 (8字法)这种方法也是大家最常见的细胞摇匀方法。横向8字摇匀法参考下图,摇动次数根据镜下观察和个人力度具体分析(参考:保证液体不被晃动出去,8字晃动5次理论上就可以基本晃匀)。摇匀结束,切忌在镜下移动观察视野太久,以免伴随着轻微的移动,细胞又往中间聚集。

第三 (十字法)细胞铺完板后,在水平方向上,上下左右四个方向进行移动,呈十字形状,重复5-6次。有些同学觉得十字法摇匀效果并不好,方法关键的是摇完后最好直接放入培养箱中,不要再做过多的移动(也有同学建议可以在培养箱中摇匀)。另外,同样不建议放到镜下长时间去观察。

十字类似法:细胞铺完板后,放在水平板面上先上下移动,再左右移动,每个方向5-6次。其他具体操作同十字法。

第四(震荡法):细胞悬液加完后,将细胞培养板抬高,对着灯光,从底部往上看,看细胞有没有抱团。然后从底部敲击,使之分散。如果实验室有平板振荡器的话,我建议用这个仪器稍振荡一下,效果不错,就是振幅小,频率高的那种。(个人不太推荐这种方法,板子接触振荡器后增加了染菌的风险,而且转速的调节和时间的掌握比较困难)。


 

 
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