② 加入细胞悬液
(1)铺6孔板,12孔板或24孔板
为防止表面张力导致的中间液面太低细胞聚集的现象,通常在每一个孔加少量的无血清培养基,不用太多,浸润孔底即可。一般可加一个孔,浸润,再用移液枪移取,再加入第二个孔,浸润,依此类推。
如果培养液量少,由于瓶体内液体有向边缘吸的特性,所以造成中间低洼,细胞容易聚集,可以多加点液体缓解。
然后加入细胞悬液,从孔的左边靠近底部贴壁慢慢加入,这样加液后,细胞悬液会平铺在整个孔底,细胞分散较均匀,可以避免加在中间位置和加在周边晃匀后周边细胞局部太多的现象。
细胞悬液加完后,将细胞培养板抬高,对着灯光,从底部往上看,看细胞有没有抱团。如果有抱团的话,用手指从底部轻轻敲打,使之分散。
接下来,将板放在水平板面上“十字”形摇匀(上下左右四个方向进行移动,呈十字形状,重复5-6次),这一步很重要!不可以转圈摇,因为细胞会被带到中间。摇匀后要放工作台静置一下,等细胞贴壁了,轻轻移入到培养箱中。
(2)铺96孔板
可用排枪,每孔加入100微升细胞悬液,从孔的左边靠近底部缓慢加入(加样过快容易导致细胞聚集)。加完半边板48孔后,将剩下的未加的细胞悬液再混一下,再继续加剩余的半边板子。
加完所有的时候,盖上盖子,左手轻轻扶住板的左边,右手轻轻敲击板的右边缘,注意把握力度,敲三次即可,太大力或次数太多会导致细胞集中成堆。将板顺时针旋转(逆时针效果不好),依次敲击剩余三个边,然后静置约5min,放置培养箱。
注意事项:
★ 用排枪吸取时,一定要保证每个枪头吸上来的悬液体积一致。
★ 如果是用于进行MTS等长时间测试时,最外圈应空余出来(中间60孔为最佳),加入PBS或细胞悬液(做空白或阴性对照),以防止培养基蒸发引起的边缘效应。
培养箱里面或者外面尽量不要放可以产生振动的仪器,比如离心机、涡旋器一类的仪器。
#细胞铺板不匀解决策略#
铺板不匀解决策略:
第一:对于96孔板,每孔通常加入100μL细胞悬液。加样方式为倾斜枪头,从孔的左边靠近底部缓慢加入(加样过快同样容易导致细胞聚集)。笔者建议,每加完半拉板子时,把细胞重新混匀,继续加样。加样结束后,镜下观察如有局部不均匀现象,可以采取敲击法,具体操作如下:将板子置于台面上,左手持住板子的左边,右手轻轻敲击板子的右边缘(5-8次),力度太强或次数太多会反而更易导致细胞聚集。将板子顺时针旋转,依次敲击剩余三个边(据说逆时针效果不好),静置约5-10分钟后,放入37℃培养箱。
对于6孔板、12孔板或24孔板,为防止表面张力导致的中间液面太低细胞聚集的现象。通常每孔首先滴加少量培基,轻轻晃动浸润整个孔底以保证板子的孔底都是湿润的,这样加液后细胞悬液会平铺在整个孔底,可以避免加在中间位置和加在周边晃匀后周边细胞局部太多的现象,细胞分散会较均匀。注意加完细胞悬液后要放工作台静置一下(5-10分钟)。镜下观察细胞均匀度,如不均匀可采用以下8字法、十字法及震荡法等方法进行细胞均匀度处理。具体操作如下:
第二 (8字法):这种方法也是大家最常见的细胞摇匀方法。横向8字摇匀法参考下图,摇动次数根据镜下观察和个人力度具体分析(参考:保证液体不被晃动出去,8字晃动5次理论上就可以基本晃匀)。摇匀结束,切忌在镜下移动观察视野太久,以免伴随着轻微的移动,细胞又往中间聚集。
第三 (十字法): 细胞铺完板后,在水平方向上,上下左右四个方向进行移动,呈十字形状,重复5-6次。有些同学觉得十字法摇匀效果并不好,方法关键的是摇完后最好直接放入培养箱中,不要再做过多的移动(也有同学建议可以在培养箱中摇匀)。另外,同样不建议放到镜下长时间去观察。
十字类似法:细胞铺完板后,放在水平板面上先上下移动,再左右移动,每个方向5-6次。其他具体操作同十字法。
第四(震荡法):细胞悬液加完后,将细胞培养板抬高,对着灯光,从底部往上看,看细胞有没有抱团。然后从底部敲击,使之分散。如果实验室有平板振荡器的话,我建议用这个仪器稍振荡一下,效果不错,就是振幅小,频率高的那种。(个人不太推荐这种方法,板子接触振荡器后增加了染菌的风险,而且转速的调节和时间的掌握比较困难)。