背景介绍：
LncRNA（Long noncoding RNA）作为RNA三宝（miRNA、lncRNA和circRNA）之一，是一类长度超过200nt的RNA分子，它们并不编码蛋白，而是以RNA的形式在多种层面上（表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等）调控基因的表达水平。近年来的研究表明，lncRNA参与了细胞分化、细胞凋亡、免疫应答以及发育等多个生物学过程。在肿瘤细胞中，某些特定的lncRNA的表达水平会发生改变，这种表达水平的变化能够作为癌症诊断的标志物（有时是非常灵敏的诊断标志物，如前列腺癌中的DD3）和潜在的药物靶点。
虽然近年来关于lncRNA的研究进展迅猛，但是绝大部分的lncRNA的功能仍然是不清楚的。因此lncRNA的研究是一片非常广阔的未知领域，具有极大的科研价值和意义。 目前研究 lncRNA的方法主要分为两大类：（1）功能实验：通过干扰（RNAi、knockout）和过表达（over-expression）结合下游的生物学实验手段，解析目的lncRNA的具体生物学功能。（2）分子机制：即发现与目的 lncRNA 的互作蛋白（lncRNA interacting/binding proteins），最终通过互作的分子机理解析其生物学效应。
目前研究RNA-蛋白质相互作用的方法主要分为两大类：一类是寻找与目标RNA结合的蛋白质，如RNA pull-down、RAP、ChIRP等；另一类是找到与目标蛋白结合的RNA，如RIP、CLIP等。其中RNA Pull-down技术为lncRNA生物学功能的验证起到了至关重要的作用。RNA Pull-down结合体外转录与生物素标记、质谱技术，是研究非编码RNA与蛋白质相互作用的一大利器。
技术原理：
RNA pull-down作为研究RNA结合蛋白与其靶RNA相互作用的主要技术之一，是近年来研究IncRNA、circRNA与蛋白质相互作用的主要手段。其原理是使用体外转录与生物素标记RNA，然后与细胞或组织的提取液进行孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物与链霉亲和素磁珠结合，通过磁分离与孵育液中的其他成份分离。再利用游离生物素竞争洗脱复合物，通过WB实验检测特定的蛋白是否与RNA相互作用，或者运用质谱筛选RNA结合的未知蛋白。
实验步骤:
1、体外转录
目标RNA制备的一般流程包括：构建RNA过表达质粒：基因合成+测序验证；体外转录模板准备：设计含T7启动子引物；PCR扩增得到转录模板。体外转录：以PCR产物为模板，体外转录得到目的RNA。pull-down所用RNA一般采用体外转录的方式获得目的RNA全长序列，包括正义链（sense strand）和反义链（Anti-Sence strand）。也可以对目的RNA全长做分段截短探针，或针对指定蛋白结合区域制备探针。
2、RNA的标记
为了方便RNA-蛋白的富集，需要在RNA 3' 端进行生物素标记或者标签标记，然后与链霉亲和素磁珠结合，通过磁分离实现RNA-蛋白的富集。生物素标记分为逆转录标记和化学标记，生物素逆转录标记：在RNA逆转录过程加入生物素碱基，即可实现生物素标记，此方法通常用于制备生物素RNA探针。生物素化学标记：逆转录得到目标RNA后，再使用生物素标记试剂盒在RNA 3' 端进行生物素标记，此方法通常用于制备生物素化RNA。除此之外，链霉亲和素还可以识别TRSA结构，因此在LncRNA的一端加上TRSA序列，也可通过链霉亲和素磁珠磁分离实现RNA-蛋白的富集（TRSA是一段人工合成的不到200bp的片段）。
2.1 生物素化学标记RNA
通常使用Pierce™ RNA 3’端生物素化试剂盒（Thermo 20160）进行标记。该试剂盒利用T4 RNA连接酶将单个生物素化的胞苷二磷酸连接到单链RNA的3’端，效率高于 > 70%。3’端的末端标记不干扰RNA结构，因此，该生物素标记不会影响RNA与蛋白的互相作用。
3、RNA-蛋白结合与洗脱
生物素化RNA与链霉亲和素磁珠结合，生成生物素RNA-链霉亲和素磁珠，通过与样本共孵育形成复合物；生物素 RNA -链霉亲和素磁珠复合物富集目的蛋白；通过洗涤非特异性吸附蛋白，再利用游离生物素竞争洗脱得到目的蛋白。
4、SDS-PAGE分析及银染、WB检测、LC-MS 鉴定
银染检测：SDS-PAGE电泳银染检测富集蛋白的情况。WB 检测：通过WB 实验检测特定的RNA 结合蛋白是否与RNA 相互作用。质谱鉴定：通过质谱鉴定实验组与对照的差异蛋白，进而筛选可能的互作蛋白。pull-down分离纯化lncRNA互作蛋白，lncRNA sense strand 和anti-sense strand分别与目的细胞的提取蛋白质孵育，将富集蛋白进行SDS-PAGE电泳分离和银染，在sense strand 中86 kD处黑色三角标注的特异性的差异条带，分别切割后进行LC-MS鉴定。从结果可见，lncRNA 的 sense 与 anti-sense 链的蛋白质捕获产物有明显的差异条带，证明 pull-down 成功。因为该 lncRNA 是 sense 链在细胞中起作用，故而将 sense 链中86 kD处黑色三角标注的条带分别进行了 LC-MS 鉴定，最终筛选 lncRNA 的特异性互作蛋白，然后利用WB证实pull-down的蛋白为STAT3蛋白。进一步通过RIP-qPCR反向验证，证实STAT3蛋白可以与lnc-DC RNA结合。
题外：
前面提到目前研究RNA-蛋白质相互作用的方法主要分为两大类：一类是寻找与目标RNA结合的蛋白质，如RNA pull-down、RAP、ChIRP等；另一类是找到与目标蛋白结合的RNA，如RIP、CLIP等。在大多数高分文章中作者会同时使用RIP实验和RNA pull-down 实验从蛋白角度和RNA角度验证了RNA与蛋白的相互作用，极具说服性。同时也体现了实验设计的创新性和严谨性。有人说，既然已经用RNA pull-down进行了验证，就没必要再用RIP？其实不然，虽然RIP和RNA pull-Down都是研究RNA和蛋白互相作用的经典方法，但是二者的出发点不同，RIP是指RNA Binding Protein Immunoprecipitation，同RNA pull-down原理相似，是从蛋白角度出发研究蛋白RNA相互作用的技术。其原理是运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，经过分离纯化对结合在复合物上的RNA 进行q-PCR验证或者高通量测序（RIP-Seq）分析，以证实蛋白与RNA间的互作。而RNA pull-down 是用已知的RNA去pull-down蛋白，再用Western Blotting和LC-MS 验证以证实蛋白与RNA相互作用的技术。因此二者是分别从不同的角度去验证，当两个实验都是阳性结果，才能说明二者之间确实存在互相作用，实验更加严谨，更具说服力。
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