凝胶电泳是分析复杂蛋白质混合物、分析某一蛋白质或者多肽相对含量的一种常用方法，是一种检测蛋白质纯度、评估蛋白质分子量的强有力的生化分析方法。在电泳系统中,蛋白条带染色是一个重要的步骤，因为它直接关系到试验结果能否使用。目前，常用的凝胶上蛋白质染色方法主要有考马斯亮蓝染色法、银染法、负染法和荧光染色法。
考马斯亮蓝染色法
1、原理：
1963 年 Fazekas 等首次将考马斯亮蓝 R-250 应用到醋酸纤维素膜上的蛋白质染色。1965 年 Meyer 等将此方法用于聚丙烯酰胺凝胶电泳。检测灵敏度约为 0.2~0.5 μg。
它的原理是：考马斯亮蓝是二磺酸化的三苯甲烷类染料，在酸性条件下，其可通过染料的磺酸基和蛋白质上质子化的碱性氨基酸间以静电力相结合。其次，还可通过染料的疏水性残基和蛋白质的疏水性区域的作用产生疏水性力，同时也存在氧键和范德华力的作用。
目前广泛用的考马斯亮蓝有G-250和R-250两种，R-250比G-250少2个甲基。其中考马斯亮蓝G-250由于与蛋白质的结合反应十分迅速，常用于蛋白质含量的测定，也可染胶，但脱色较慢较难。考马斯亮蓝R-250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以常用来对电泳条带染色。
2、特点：
优点：由于考马斯亮蓝具有成本低、操作便捷及质谱兼容性好等特点，使得该类染料成为最常用的蛋白质染色染料。缺点：染色灵敏度较低，约为几十纳克到几微克，对低丰度蛋白质的显现较差；染色时间较长，且凝胶有比较深的颜色背景，需要较长时间的脱色，影响实验效率；由于使用甲醇和冰乙酸等有毒或有刺激性气味试剂，对操作者的身体有害。改进方向：不断有研究者针对蛋白质的考马斯亮蓝染色方法进行优化，各项技术指标如灵敏度、染色时间、无毒无污染和凝胶背景都有显著的改善，目前市面上出现快速、高灵敏、低背景、无毒无污染的考马斯亮蓝染色液，5 min就能染色10 ng/band，且背景极低，纯水漂洗处理即可进一步降低背景。
银染法
1、原理：
1979 年，Switzer等发明了比考马斯亮蓝染色灵敏2个数量级的银染色方法，它可以检测小至 0.38 ng/mm2 的牛血清白蛋白（Switzer R.C., Merrill C.R., Shifrins. A highly sensitive silver stain for detecting proteins and peptides in polyacrylamide gels. Anal Biochem, 1979, 98(1): 231-7.）。
银染法的原理是，在溶液条件下银离子能与蛋白质的天冬氨酸和谷氨酸上的羧基通过静电力相结合，同时银离子还可与组氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸和赖氨酸上的咪唑、巯基、甲硫基和氨基结合；接着，与蛋白质结合的银离子在甲醛等还原剂的还原作用下生成黑褐色的金属银使蛋白质显色。
2、特点：
优点：灵敏度高，可以检测到0.25~1 ng的蛋白质，非常适合低丰度蛋白质染色。缺点：甲醛的使用让凝胶中蛋白化学交联，导致质谱不兼容；线性范围窄，不太适合量化；染色步骤复杂，染色过程污染较大，费时费力(需要8～ 16h)；试剂成本较高，需要接触有毒的甲醛；而且,核酸、脂多糖、脂类、醣脂类化合物常会对银染染色的结果进行干扰，导致实验重复率低。改进方向：银染方法还在不断改进，主要是提高灵敏度、缩短染色时间和简化操作。目前出现与质谱法兼容但以牺牲灵敏度为代价的银染色方案。
荧光染色法
1、原理：
针对考马斯亮兰染色虽然快速但是灵敏度不够，银染法虽然灵敏度高但是背景较高，结果容易受到核酸污染等缺点,人们尝试用荧光染料对凝胶中的蛋白质条带进行染色。荧光染色法原理是：荧光染料通过静电作用与SDS包裹的质子化蛋白质相结合，搭配荧光扫描仪成像来检测蛋白。
2、特点：
优点：蛋白质荧光染色法具有线性范围广,灵敏度高(1~100 ng／band)，质谱兼容性好，比较适合高通量蛋白质组学的研究。
缺点：需要使用强烈气味和刺激性的试剂，且试剂价格昂贵；荧光染色需要相对较长的处理时间，并且需要诸如荧光成像扫描仪和高级软件之类的特殊设备；荧光染料标记蛋白后会改变其在凝胶中的迁移性质，不同蛋白质样品含有与荧光染料反应的氨基残基不同，导致最终检测到的信号差别较大；电泳前进行染料标记容易使蛋白质产生发夹结构，造成蛋白质在从凝胶向硝酸纤维素滤膜上转移时出现障碍；此外，荧光染料的化学稳定性差、光漂白和光降解现象比较严重。以上因素导致其普及和使用率均较低。
改进方向：由于荧光染料价格昂贵，染色成本高，需要探索更加优良易得，价格便宜的荧光染料。
负染法
1、原理：
1987年，Lee C等首次发明了蛋白质铜负染法，只需五分钟即可SDS-PAGE 凝胶上清晰显示6-10 ng蛋白质条带（Lee, C., Levin, A., Branton, D. Copper staining: a five-minute protein stain for sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gels. Anal Biochem, 1987, 166(2): 308-12.）。蛋白质负染法的原理是：将金属离子有选择地沉淀在胶面上，而蛋白质条带不被染色。因此，蛋白质所处区域是透明的，从而达到检测目的。主要包括氯化钾负染法、氯化铜负染法、氯化锌负染法、醋酸盐负染法、氯化镍负染法和咪唑锌负染法等。2、特点：
优点：操作便捷，成本较低。咪唑锌负染灵敏度高接近银染(1～10ng)，蛋白质与锌和咪唑的结合是可以逆转的，洗脱后的蛋白质化学性质没有改变，从而具有良好的质谱兼容性。缺点：该方法的对比度较差，且重现性受到诸多物理化学因素的影响(例如染色液的pH,胶中阴离子的浓度、温度等)，因此限制本方法的广泛使用。改进方向：因为负染后的条带是透明的，需要提高对比度。
综上所述，目前围绕染色方法的改进主要集中在如何提高染色灵敏度，操作是否简捷，成本是否低廉及操作是否安全等方面。上述各类方法经几十年的发展虽都取得了一定的进展，但还是存在许多不足之处有待于改进。例如：①染料染色法虽操作简单，质谱兼容性良好，但灵敏度还需提高；②银染法仍然是目前最灵敏的染色方法，但是银染法背景较高，需要接触诸多的有毒物质,长期操作会影响科研人员的身体健康，此外，质谱兼容性差和操作步骤繁琐的问题有待改善；③荧光染色法灵敏度介于银染和染料染色法之间，虽在蛋白质组学研究中具有较大的优势，但是荧光染料染色往往会改变凝胶中蛋白质条带的化学性质，给进一步的分析造成障碍；而且，荧光染色的结果需要专业设备才能检测，此外，寻找更加稳定、灵敏、安全的荧光染料，缩短操作时间仍是荧光染色法所需要解决的问题；④负染法可以较好地克服上述诸多缺点，但是负染的重复性依赖于许多物理化学因素，而且，因为负染后的条带是透明的，还有待提高对比度。简而言之，蛋白染色领域中需要一种快速染色、染色灵敏度高、染色环保、价格低廉且与质谱兼容的染色液。
题外：
有报道称蛋白质色氨酸残基与三卤化合物在紫外光作用下，生成蛋白质荧光衍生物，其发射波长在近紫外和可见光区。因此，在凝胶中加入三卤化合物，一旦蛋白质通过电泳在凝胶中分离成条带则将凝胶置于紫外灯下，三卤化合物与凝胶中蛋白质上色氨酸氨基实现共价偶联生成荧光衍生物，通过荧光扫描成像即可检测蛋白，实现免染检测蛋白。
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