SDS-PAGE电泳的基本原理：
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用，由此建立了SDS-PAGE电泳技术。1970年，Laemmli发明了loading buffer，开创了SDS-PAGE电泳新纪元，广泛应用于蛋白质分析，尤其是WB实验。当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙醇，巯基乙醇可以将存在于蛋白质的肽链上半胱氨酸残基之间的二硫键(S-S键)还原为游离巯基，破坏蛋白质四级结构，样本中的蛋白只保留蛋白二级和三级结构。SDS能断裂分子内和分子间氢键，在加热条件下，彻底破坏蛋白质的二级和三级结构。由于十二烷基硫酸根带负电，经SDS处理后，使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质-SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，这样的蛋白质-SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。
SDS-PAGE电泳系统
（一）电泳形式
聚丙烯酰胺凝胶电泳目前是应用最广泛的电泳技术，其凝胶为网状结构，具有分子筛效应。它有两种形式：非变性（Native-PAGE）和变性（SDS-PAGE）。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）是在不加入SDS等变性剂和巯基乙醇、DTT等还原剂的条件下，对非变性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。亚单位之间的相互作用、蛋白质构象和生物学活性被保留。常用于研究一些蛋白的二聚体或多聚体等。Western Blotting实验时，相对广泛采用的是SDS-PAGE。对于SDS-PAGE，是在电泳体系中加入变性剂SDS和还原剂DTT或者巯基乙醇等。所以SDS-PAGE检测时，可以利用分子筛效应将蛋白质依据分子量大小分离开来。
（二）电泳缓冲系统
PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。不连续体系由电泳缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。电泳凝胶分为两层：上层胶为低浓度的大孔胶，称为浓缩胶或成层胶，配制此层胶的缓冲液是Tris-HCl，pH 6.8；下层胶则是高浓度的小孔胶，称为分离胶或电泳胶，成胶的缓冲液是Tris-HCl，pH 8.8。电泳槽中的电极缓冲液则是Tris-甘氨酸，pH 8.3。可见，凝胶浓度、成胶成分、pH与电泳液缓冲系统各不相同，形成了一个不连续系统。SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。不连续缓冲系统最早是由Ornsstein(1964)和Davis(1964)开发的，通过在Tris- HCl/Tris-甘氨酸不连续缓冲系统中，用pH 6.8的低浓度浓缩胶覆盖pH 8.8的高浓度分离胶。此系统具有两种去堆积方法：①蛋白堆积形成后减慢蛋白的移动速度，分离胶具有更高的浓度，孔径小，能够延缓蛋白质的运动；② 一旦蛋白被堆积，加速后随离子的泳动速度，分离胶的pH值(通常pH = 8.8)较大，甘氨酸离解度加大，加快其电泳速度，超过SDS-蛋白复合物。1970年，Laemmli将这种系统应用到SDS-PAGE蛋白电泳，基本上保持了相同的特点（The electrode buffer (pH 8·3) contained 0.025 M Tris and 0.192 M glycine and 0-1 percent SDS）。时至今日，虽然出现多种电泳缓冲液，但LaemmLi 使用的 Tris-甘氨酸-SDS缓冲液仍然是现在最常用的缓冲系统，成为经典的电泳缓冲液。
（三）上样缓冲液（loading buffer）
Laemmli缓冲液的名称来自于Ulrich K.Laemmly教授，他在20世纪70年代改进了SDS-PAGE的程序，该缓冲液根据蛋白质的大小为蛋白质的质量分离创造了良好的条件。其原理是在SDS和热力作用下破坏保持蛋白质二级和三级结构的氢键；而还原剂，如β-巯基乙醇，则裂解二硫键破坏蛋白质四级结构；蛋白质被线性化并与SDS复合，因此所有的蛋白质都具有相似的质量电荷比。这就消除了结构和电荷的影响，在进行电泳时，蛋白质仅根据其分子量的不同而被分离。Laemmli缓冲液包括：（1）十二烷基硫酸钠（SDS）；（2） 硫醇试剂，如 β- 巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）；（3） 甘油；（4） 三羟甲基氨基甲烷（tris）；（5）电泳指示剂，如溴酚蓝。现在常用的 loading buffer 也是以 Laemmli 样品缓冲液为基础进行改良的（Laemmli, U. K. . Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. nature.1970, 227(5259): 680-685：The samples (0.2-0.3 ml.) contained the final concentrations (" final sample buffer"): 0.0625 M Tris--HCl (pH 6.8), 2 percent SDS, 10 percent glycerol, 5 percent 2-mercaptoethanol and 0.001 percent bromophenol blue as the dye. ）。
Loading buffer 的作用
（1）loading buffer 中的 SDS 破坏保持蛋白质二级和三级结构的氢键，可以覆盖蛋白质本身的电荷，赋予蛋白质净负电荷，同时与硫醇试剂一起使蛋白质线性化，在电泳时蛋白质的分离只与蛋白质分子大小有关而与形状等无关。
（2）loading buffer 中的硫醇剂，如β-巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT），用于减少含硫氨基酸（如半胱氨酸）之间产生的二硫键。此外，由于硫醇剂具有抗氧化特性，因此能够防止半胱氨酸的氧化。因此，硫醇试剂与SDS协同作用，使蛋白质线性化。
（3）loading buffer 中的甘油可以增加样品的密度，确保样品向下移动到点样孔中，防止样品飘出点样孔。
（4）loading buffer 中的 Tris 可以将缓冲体系的 pH 保持在 6.8 左右，防止在低温保存的过程中蛋白质肽键断裂，保证了蛋白质的稳定性；同时，Tris 可以抑制酶促反应并防止蛋白酶降解蛋白质。
（5）loading buffer 中的溴酚蓝在视觉上指示样品在凝胶中的位置（示踪染料），以便适时终止电泳。
Loading buffer 的配制
5X 浓缩 loading buffer 配方（仅参考）：300 mM Tris-HCl（pH6.8），5%（W/V） SDS，0.5%（W/V）溴酚蓝 ，50%（V/V） 甘油，5%（W/V）β-巯基乙醇（非还原电泳可不加）。5X浓缩的 loading buffer 可在 - 20℃下储存至少一年。
具体操作：
使用 loading buffer 处理蛋白质样品后还需要加热（通常 95℃左右）处理 3~5min，这样做的目的一方面可以破坏蛋白质的高级结构，使其变成线性分子；另一方面促进蛋白质和 SDS 结合，形成蛋白质 - SDS 胶束（长椭圆棒状），使蛋白质带上负电荷，便于在 SDS-PAGE 中分离。此外，loading buffer 处理样品对抗体孵育步骤也很重要，蛋白质的线性化可使蛋白抗原表位充分暴露，以增加蛋白抗原与特异性抗体的识别及结合能力。这也是WB实验在发展过程中采用SDS-PAGE电泳的原因之一。
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