蛋白Marker定义和用途

蛋白Marker：即蛋白分子量标准，是一些已知分子量的蛋白质的混合物，像“尺子”一样用来指示蛋白质条带的大小。

在Western Blot过程中，分子量Marker就像个螺丝钉一样虽然是其中小小的一环，然而就是这样一个小细节对实验结果有着不可忽视的作用。Marker的作用主要是用来指示蛋白条带所对应的分子量大小，只有标准量精确无误了，实验结果才有说服力，除此之外，蛋白Marker还有显示转膜是否成功、以及蛋白在凝胶上的电泳程度等作用，因此选择正确的蛋白Marker也是Western Blot实验成功的必要条件之一。

蛋白Marker的分类

总体来说，目前最常用的蛋白Marker分为非预染蛋白Marker和预染蛋白Marker。

非预染蛋白Marker

是几种已知分子量并纯化好的蛋白质预混液，方便不同大小的蛋白比较。非预染的Marker使用上不如预染Marker好用，因为电泳过程中完全看不到，电泳结束后经过蛋白染色后才能起指示作用，无法在实验过程中起预示参照作用，属于“后知后觉”型的。但是由于蛋白没有附带染料分子或者是标记分子，所示大小正好是蛋白原本的大小，所以比较准确，可以精确判断蛋白大小。

预混的Marker通常有几条带加倍浓度作为指示，因为混合的条带越多，越不好记，谁知道哪条是那条！数到眼都花了。所以当看到特别浓的那几条标志带就记得是哪里了。不过要记得，小带通常都不那么容易看清楚的。在选择上来说，当然是选择其中至少有一条条带和自己的目的蛋白大小相近的最好，越近越好。

预染蛋白Marker

预染蛋白Marker是纯化好的一些蛋白，通过与染料共价耦联后混合在一起，在电泳过程中或者转膜时可以直接观察到。

预染蛋白Marker的出现方便了我们的实验，这种蛋白分子量标准可以帮助我们在电泳时、电泳后，以及转膜后监测电泳情况和估计迁移率——比如，已知垂直电泳最佳分辨区域大约在胶的2/3处，如果使用预染Marker就可以预测目标蛋白进入最佳分辨区时停止电泳以得到最佳分辨效果；如果观察到Marker电泳异常也可以及时终止电泳；另外在Western Blot转膜以后可以直接观察蛋白转膜是否完全，还可以在膜上标记蛋白分子量，所以吸引了许多实验室人员购买预染蛋白标准。

值得注意的是，预染蛋白Marker与染料共价耦联，所以在不同的缓冲条件下电泳时迁移特性可能会发生某些变化，可能导致一些偏差，所以不太适合精确定位蛋白——不过多数情况下Marker的条带未必能和我们的目标蛋白完全一样，我们得到的也不过是一种相对Marker指示的参考大小，最后都需要Western来定性，所以如果不是要区分大小相近的条带，预染Marker还是很好用的，而且也可以和未染色的蛋白标准一起使用。

预染蛋白Marker的分类

预染蛋白Marker又分：单色预染和多色预染，单色预染蛋白Marker通常会利用其中某些条带加倍浓度加深某些条带的粗细，来提示其大小的，方便我们快速记忆和区分各个条带的大小。而彩色蛋白Marker则用不同的颜色来区别，就更加好辨认啦。而且如果沉闷的电泳实验中跑出多彩的彩虹Marker，此时心情想必会愉快一些！ 

三色预染蛋白Marker,

(10-245kDa)

高低分子量彩虹

(43- 315 kDa)

除了上面介绍的，市面上还有一些其他类型的蛋白Marker：如荧光蛋白Marker、生物素化Marker、显影蛋白Marker等…。

此外，蛋白Marker按分子量范围又分为高分子量、低分子量、宽分子量几类。检测大分子量蛋白经常使用到高分子量范围Marker，检测小蛋白甚至是一些多肽常会用到小分子量范围Marker。如果从整个实验室考虑，选宽分子量、条带分布比较均匀的Marker，这样你的蛋白无论在哪个区间都容易判断。

Marker的一些问题 

一、marker一定要都跑出来吗？

比如说说明书上市7条带，其实跑出6条带是正常的,可能是跑的时间不够,如果你的蛋白不是很小的话,可以等溴酚蓝前沿刚跑出胶的时候再关电泳仪,这样应该可以有7条带.有的时候还会跑出5条,不过只要在你的目的蛋白的上下两个带都跑出来了就可以了,不一定非要7条。

二、marker变成笑脸状怎么办？

第一，胶没有压片

第二胶在板的边缘与中心的胶的流动性可能不同，这个没有办法，跟黏度和表面张力有关。如果各种方法都不能解决上面的现象，个人建议maker换一条道上样，选一条靠近中间的泳道跑一跑。

边缘效应，在边缘两个泳道的样品会这样的。可以试试电泳速度慢点儿......

要么配胶时没压好，胶没配好，要么电泳时电压太大，电渗力强，要么玻板电泳时没夹好，内电泳液是漏的，请逐一排查。

三、marker条带变宽怎么解决？

原因一：上样量过多，应该减少上样量。

对策：加样体积根据样品浓度和凝胶厚度灵活掌握。一般上样体积为10-15μL（即2-10μg蛋白质）。如果样品很稀上样量可以达到100μL。

原因二：样品溶解不完全。

对策：(1)样品应该充分溶解：保持各种蛋白质样品和Marker在上样前能够充分溶解，上样前最好离心一下，实在溶解不掉的颗粒就去掉。

(2)可以根据分子量标准的蛋白质试剂盒的要求加入样品溶解液；如果是自行配置标准和未知样品，按照0.5-1.0mg/L样品溶解液。溶解后，将其转移至Ep管，盖上盖子（可以在盖子处加上卡子）后在110度沸水中水浴加热3分钟（可以在薄泡沫塑料板上钻出几个与Ep管直径形同的圆洞，Ep管放下去直到盖子边缘约束不能再往下为止，把薄泡沫塑料板的暴露出Ep管的管体大部分的那一面放入沸水浴锅中，薄泡沫塑料板自然飘在沸水表面，便于取用和加热，也可避免沸水溅起。

可以一批对于多个Ep管进行不同时间的沸水浴。不要把Ep管扔进沸水浴锅中，盖子可能会被冲开），而后在室温下冷却待用。如果较长时间不用，则将样品放入零下20度冰箱中储存，需用时在取出后使用前在110度沸水中加热3分钟室温冷却后再上样，以去掉样品蛋白质中的亚稳态聚合体。

(3)改变样品缓冲溶液使得样品能够充分溶解，SDS 用量要充分。

原因：SDS电泳带与邻近蛋白质电泳相连。除了上样量过多和样品溶解不完全外，凝胶的加样孔泄露会使得电泳带变宽。加样孔泄露往往由于凝胶与玻璃板之间产生裂纹引起。对策：此时只能重新制备凝胶，梳子拔起时要小心等凝胶凝聚完毕，速度不宜过快，拔起的方向要垂直于凝胶表面；要避免凝胶两侧的玻璃板与凝胶之间产生裂纹，在凝胶制备过程中不要挤压凝胶两侧的玻璃板。