2. 选择正确的二抗形式
选择合适且正确的二抗形式，也是获得实验成功的关键之一。四种二抗形式Whole IgG、F(ab')2 、F(ab')、Fab如下图所示。
“Y”型的二抗分子可以被酶水解成四种不同的形式
3. 抗体特异性的选择
要注意区分二抗的特异性和形式的不同，特异性指的是二抗识别的不同一抗亚型或某特殊区域；形式指的是二抗的不同结构形式。抗体的特异性主要基于以下三种形式：
（1）亚型特异性：
除了要与一抗的种属来源相一致，二抗还需与一抗的类别或亚类相匹配，这通常是针对单克隆抗体而言。一般来说多克隆抗体主要是IgG类免疫球蛋白，因此相应的二抗就是抗IgG抗体。而单克隆抗体则相对复杂些，由于单克隆抗体有不同的类别和亚型，因此相应的二抗也需要根据这些亚型进行选择。
单克隆抗体的类别及亚类通常会在产品说明书中都会有描述，如果一抗是小鼠IgG，那么相应的二抗就应当是抗小鼠IgG抗体。如果单克隆一抗是小鼠 IgG的某一亚类（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么几乎所有的抗小鼠IgG都可以与之结合，或者也可以选择专门针对这一亚类的二抗，例如，如果一抗是小鼠IgG1，那么可以选择抗IgG1的二抗，此种抗体在双标记实验中尤其适合。在不清楚一抗为何种类/亚类的情况下，可以选用抗相应物种IgG，因为此种抗体可以识别大多数类型的IgG免疫球蛋白。
（2）轻链（lambda，kappa）特异性：
与所有类别的抗体反应，因为所有类别的抗体均具有相同的lambda链或kappa链。
（3）Fc片段或重链特异性：
这类抗体和重链或Fc部分反应，它们具是类别特异性，即γ链特异性抗体只与IgG反应，μ链特异性抗体只识别IgM，依此类推。
（4）针对整个抗体分子（H＋L）特异性：
此类抗体既可以与抗体的重链结合也可以与轻链结合，即与抗体分子的Fc、F(ab')2、Fab部分均可反应，anti- IgG(H+L)也可以与其他免疫球蛋白家族反应（如IgM和IgA），因为所有的免疫球蛋白都具有相同的轻链（κ链或λ链）。
（5）针对Fab片段特异性：
这类抗体与重链轻链均可以结合，由于它们可以与轻链反应，它们同时也可以和具有相同轻链的其他种类的免疫球蛋白反应。
4. 二抗的种属来源
一般来说，不同的种属来源与二抗的质量没有必然的联系，来源于山羊的二抗与来源于驴的二抗在一般的实验里没有太多的差别。然而在一些特殊的实验里，如双标实验里，如果其中一个一抗是山羊来源的，一个是小鼠来源的，则相应的二抗分别要抗山羊和抗小鼠的二抗，这时候，二抗就不能选择山羊或者小鼠来源的。选择相应的驴来源的二抗，就非常适合做类似双标的免疫实验。因为双标得2个一抗都抗才行，故选择第3个种源的抗体。
5.偶联标记的选择
一般来讲，偶联到二抗上的探针主要有酶，荧光基团（FITC/Dylight/Alexa Fluor）和生物素。选用哪种探针的二抗主要取决于具体的实验。对于Western blot和ELISA，最常用的二抗是酶标二抗，而细胞或组织标记实验（细胞免疫化学，组织免疫化学，流式细胞术）中通常使用荧光基团标记的二抗，免疫组化中也可以使用辣根过氧化酶或碱性磷酸酶标记的二抗。如果想要更大程度的放大检测信号，可以使用biotin/avidin检测系统。在一些荧光检测方案中，则需要选择不同的荧光标记；而金颗粒标记的二抗则更多的应用于免疫电镜中。
不同实验类型适合的标记类型不一样，如下表所示：
对于多标染色实验，下面有几种常用的配色参考（除细胞核染料外）：
基于不同实验类型的二抗使用指南
1.常规WB实验：
选择Whole IgG全片段二抗
对于常规的WB实验，在基于正确的种属来源和反应物种原则上，一般选择酶标或生物素标记的没有特殊形式的全片段二抗。
2. 荧光WB实验：
选择带有荧光基团的Whole IgG二抗
与化学发光WB实验所使用的酶标记二抗不同的是，荧光WB需选择带有荧光基团的二抗（如FITC/Dylight/Alexa Fluor荧光二抗）。
使用带有Alexa fluor680和Alexa fluor790基团的二抗进行荧光WB实验的示意图
3.IP后WB实验：
根据目标蛋白分子量，选择轻链特异性二抗或Fc片段特异性二抗
在IP或Co-IP实验中，IP实验及之后的WB实验的操作过程中通常会用到相同的一抗或同种属来源的一抗、这种情况下，如果使用常规无特异性的Whole IgG酶标二抗，WB实验中IP抗体变性后产生的重链（55kDa）和轻链（25kDa）都能够识别， 而此非特异的信号往往会部分甚至完全掩盖目的蛋白的信号。为了避免以上情况：
（1）选择只和重链或轻链反应的二抗
当目标蛋白位于55kDa分子量附近时，需要选择抗轻链（anti-light chain）的二抗，以避免重链的干扰；反之，当目标蛋白位于25kDa分子量附近时，需要选择抗重链或抗Fc端的二抗，以避免轻链的干扰。
（2）选择WB一抗时，选择和IP用一抗不同的种属，避免IP一抗的干扰；
（3）选择HRP直接标记的WB一抗，省去二抗的步骤。
4.IHC/ICC/IF实验：
选择F(ab') 形式的二抗
在研究某些细胞和组织时（如白细胞群体：巨噬细胞、B细胞、自然杀伤细胞等；某些组织：淋巴结，脾脏，外周血等），这些细胞或组织因表面Fc端受体过多，会与抗体分子中的Fc端相结合，从而导致非特异性结合和高背景的现象（如下图所示），俗称“假阳性”。使用F(ab') 形式的二抗可以避免其与活细胞中的Fc受体非特异性结合，还可避免与Protein A、ProteinG的非特异性结合，从而提高实验准确性。
使用F(ab') 片段二抗可以避免“假阳性”情况
5. 多标记染色IF/IHC实验：
选择经预吸附处理的二抗
预吸附是一种增加二抗特异性和最小化非特异性结合的方法，通过使抗体通过一个含有固定血清蛋白或免疫球蛋白的柱从而避免潜在交叉反应的物种。反应性抗体与固定化蛋白结合，而非反应性抗体通过。比如二抗预先经过人血清吸附，相当于在抗体制作过程中，该二抗可能与人样本结合的位点已经被结合，如果样本来自人源，那么该二抗就能有效避免和人样本再发生交叉反应。
在图示的预吸附过程中，大鼠和小鼠的免疫球蛋白或血清蛋白被固定在柱上。将含有大鼠、小鼠和兔二抗的样品通过柱。与大鼠和小鼠蛋白反应的抗体结合在柱上，而不反应的兔抗体通过。这些预吸附的兔二抗是理想的染色小鼠或大鼠样本的二抗。（1）为了防止二抗与样本，以及其他一抗种属的交叉反应，在多次标记实验中确定蛋白表达或染色富含免疫球蛋白的组织或细胞时，首先需要选择经预吸附处理的二抗，以减少这种交叉反应；
（2）所有二抗都应尽可能的来自同一宿主物种，以此来限制二抗与来自其他物种的一抗之间的交叉反应。下图给出了一种三标实验搭配参考，因样本和三支一抗的来源分别为小鼠、山羊、兔及大鼠，应选择能够去除这几种种属交叉反应的二抗。
进行三标染色实验时，样本为小鼠的二抗选择参考
（3）如果一抗种属来源于不同的亚型，那么二抗则不需要来源于不同的物种，只需要选择对应的亚型特异性二抗即可。
一抗种属来源于不同亚型的三标实验
5.一抗来源相同的双染IF实验：
选择Fab形式的二抗
有时因受限于实际的实验条件，在进行双染色的IF实验时，一抗来源于同物种。这时可以选用Fab片段二抗来进行实验，这是因为每个Fab片段二抗只含有一个抗原结合位点，因此在随后的孵育过程中不会与另一个分子相结合(即在进行顺序双标记时的第二个一抗)。
以下有两种使用Fab片段二抗进行双标记染色的方法可供大家参考：
（1）来自同一种属的两种一抗均未标记时
（2）来自同一种属的一种未标记一抗和一种或多种标记的一抗
不建议使用F(ab')2片段抗体进行双重标记实验，因为其为二价分子，含有两个结合位点。在与第一个一抗结合之后，第二个结合位点可能仍未被占据，而这个未被占据的结合位点能够与第二抗体结合，导致假阳现象。
Fab片段二抗还可用于封闭内源性免疫蛋白：
当一抗与所研究组织种属来源相同时(例如，小鼠一抗用于小鼠组织)，可以使用Fab片段二抗来阻断内源性免疫蛋白以减少背景染色，从而提高实验的准确性。
（a）未封闭的内源性免疫蛋白会与随后加入的二抗结合，干扰实验。（b）经过Fab片段二抗封闭后，内源性免疫蛋白不会与随后加入的二抗结合。
