免疫细胞化学 (ICC) 是一种使用荧光抗体或染料来检测细胞内靶抗原的技术。ICC 实验流程通常包括细胞培养与固定、通透处理、封闭、一抗孵育、二抗孵育和封片观察 6 个部分。
1.1细胞培养/固定
很多抗原在离体组织中只存在很短时间，自溶和坏死使得抗原进一步降解，组织形态和结构被破坏。样品浸泡在合适的固定液中，固定液完全渗透组织，使蛋白失去活性，并且使组织被「保存」、稳定在接近 in vivo 状态。
细胞培养是 ICC 实验的基础，细胞状态直接影响 ICC 实验结果。不管是悬浮细胞还是贴壁细胞，进行 ICC 实验时都需要确认以下注意事项：
01. 交联试剂有利于保护细胞结构，但是会产生蛋白交联，可能会降低抗原性
02. 预冷的有机溶剂固定会吸去脂类使细胞脱水、蛋白变性，通常不需要对细胞进行额外的通透处理。
对于定位不同的抗原需采用不同的固定方案：
01. 对于细胞核抗原，可以尝试对细胞使用 4% PFA 室温固定 10-20min。
02. 对于细胞浆抗原，可以尝试对细胞使用 -20℃ 预冷甲醇 -20℃ 固定 5-10min。
那么该如何挑选合适的固定剂呢？且往下看：
可溶性溶剂比如丙酮、乙醇等能去除脂类物质并使细胞脱水，把蛋白质沉淀在细胞结构上。交联剂比如多聚甲醛可以通过自由氨基基团把生物分子桥连起来，形成一个相互连接的抗原网。
组织或细胞经过固定后可使胞内蛋白凝固，减少或终止外源性酶和内源性酶的反应；保持组织或细胞的抗原性，避免抗原发生弥散；保持组织和细胞的固有形态和结构。
1.2通透处理
通常，当抗体检测细胞内蛋白时（包括抗原表位在胞内段的跨膜蛋白），需要对细胞进行通透，一般将细胞样品在含 0.1-0.25% Triton X-100 的 PBS 中孵育 5-10 分钟。
1.3封闭
对样本进行封闭，同样是为了阻断抗体抗原之间的非特异结合，降低背景和潜在假阳性染色。
1.4一抗孵育
1.4.1 选择一抗
需要考虑的要点
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产生一抗的来源种属与要检测的种属不同
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一抗是否能与目标蛋白结合？
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是否曾证实一抗在您的应用中有效？
1.4.2 抗体特异性
抗体特异性最确凿的证明是，在目标蛋白已被敲除的组织或细胞中缺乏染色。
其他指标有
1.4.3抗体浓度
确定最佳或最优的抗体工作浓度，可以使特异性染色最大化并减少背景。不熟悉抗体稀释度的小伙伴也可以根据相应产品说明书推荐的起始浓度进行尝试。
【使用何种稀释度：
抗体和抗原之间的结合率、亲和常数可受温度、pH 和缓冲液成分的影响。改变溶液中抗体和抗原的相对浓度也可控制抗体-抗原复合物的形成程度。由于我们通常无法改变抗原的浓度，因此必须针对每种应用和每组实验条件，通过稀释来确定每种抗体的最佳工作浓度。
优化抗体稀释度：滴定实验
可实现最佳染色效果和最低背景信号的最优抗体浓度必须在每次分析中通过实验方法单独确定，常用的方法是涉及一系列稀释度的滴定实验。例如，如果产品数据表推荐的稀释度为 1:200，我们建议您采用 1:50、1:100、1:200、1:400 和 1:500 的系列稀释度来确定最佳浓度。
1.5二抗孵育
对于间接检测，二抗是成功显示一抗分布的关键。使用二抗和相关检测系统能够扩增信号，因为不止一个二抗分子与单个一抗结合。
化学显色与荧光检测：您可以选择化学显色法，使用酶标记的二抗，也可以选择荧光法（免疫荧光），使用荧光染料标记的二抗进行检测。
1.5.1 荧光法
对于绝大多数实验者来说，荧光二抗一定是他们的第一选择，所以对于带有荧光基团的二抗，提醒：
1.5.2 酶显色法
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生物素标记的二抗和链霉亲和素-HRP 能进一步扩增信号。或者，您也可以使用现代 HRP-聚合物二抗。
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一些沉淀物具有光稳定性（HRP/DAB 具有很好的光稳定性，但 HRP/AEC 在阳光下会褪色），所以载玻片有可能储存多年。
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仅需要标准的明场显微镜。
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酶/显色剂沉淀物的沉积区域比来自荧光源的光子沉积区域更宽，这可能影响个人解读结果的能力。
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该过程通常耗时较长，因为它的孵育和封闭步骤比荧光方法要多 — 但是，情况并非总是如此，具体取决于您使用哪种扩增系统。
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由于酶的扩增作用，定量一般比较困难。
1.6封片观察
显色完成后，通常会对细胞进行复染，复染剂对特定的细胞结构进行染色，增加染色对比效果，明确细胞或亚细胞定位。
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