一、实验目的

通过检测处于凋亡状态的细胞数量来检验目的基因与细胞凋亡的关联或者药物对细胞凋亡的影响。

二、实验原理

在正常的活细胞中，磷脂酰丝氨酸 (phosphotidylserine，PS) 位于细胞膜的内侧，但在早期凋亡细胞中，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。

Annexin-Ⅴ能与 PS 高亲和力结合。可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。用标记了 FITC 的 AnnexinⅤ作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。细胞坏死的过程中也会发生细胞膜损伤，坏死的细胞会结合 Annexin V-FITC。

Annexin V-FITC 通常与细胞膜非渗透性核酸荧光染料联合使用以检测凋亡细胞。常用的染料是 PI。正常细胞和早期凋亡细胞的细胞膜是完整的，核酸染料 Propidium iodide(PI) 不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI 能够透过细胞膜与细胞核结合呈现红色。

将 AnnexinⅤ与 PI 匹配使用，可以将凋亡早期的细胞和晚期的细胞以及死细胞区分开来。坏死细胞可以同时与 Annexin V-FITC 和 PI 结合显色，而 PI 则被排除在活细胞 (FITC 阴性) 和早期凋亡细胞 (FITC 阳性) 之外。在没有巨噬细胞的情况下，凋亡的最后阶段会像细胞坏死一样发生整个细胞的解体，从而使凋亡晚期的细胞也同时被 FITC 和 PI 结合染色呈现双阳性。

五、实验步骤

1. 待各实验组 6 孔板细胞生长至覆盖率约为 70% 时，收集上清，胰酶消化贴壁细胞，完全培养基重悬成细胞悬液，与上清细胞收集于同一 5 mL 离心管中，每组设三个复孔 (为保证上机细胞数足够，细胞数目 ≥ 5×105/处理）。若为悬浮细胞，直接收集。

2.1000 g 离心 5 分钟，弃上清，用 PBS 轻轻重悬细胞；

3.1000 g 离心 5 分钟，弃上清，加入 195μl Annexin V-FITC 结合液轻轻重悬细胞。

4. 加入 5μl Annexin V-FITC，轻轻混匀。

5. 加入 10μl 碘化丙啶染色液，轻轻混匀。

6. 使用铝箔进行避光，室温 (20-25℃) 避光孵育 10-20 分钟，孵育过程中重悬细胞 2-3 次，随后置于冰浴中。

7. 立即上机检测

四、常见问题及解答

Q1：构建了慢病毒转染的稳转株（带绿色荧光），检测凋亡使用 FITC 也是绿色荧光，是否会干扰？

A：会有干扰，可以换红色荧光标签的试剂进行检测。

Q2：镜下观察有很多漂浮细胞，可以看到凋亡，为什么染色后跑流式，凋亡比例跟 control 差不多？

A：将漂浮的细胞收集起来再进行实验

Q3：Annexin V-FITC 和 PI 在激光共聚焦显微镜下分别选择的测量波长是多少？

A：绿色荧光可以使用 488nm 激发，PI 是红色荧光，使用 535nm 激发

Q4：FITC 和 PI 孵育时间过短，对结果有什么影响？

A：孵育时间过短，影响装载效果，时间过长，也要考虑细胞本身的状态。

Q5：想问一下用流氏检测应该怎么设门？

A：用阴性未染色的细胞调电压，门设置，annexin V-FITC 单染、PI 单染来调补偿。