之前介绍过关于基因干扰的背景知识，这次把之前总结的siRNA转染和干扰效果不佳的问题。
要保证RNA干扰的效果就必须保证siRNA能够成功的转染到细胞中去，那有时候会转染不进去，原因可能有如下几点：1、转染方法：转染siRNA浓度太低。FAM验证转染效率时siRNA(FAM)的量的终浓度是50-150nM都可以，需要根据细胞进行摸索。lipo2000的量和使用的siRNA量成比例的，一般用1:1的效果好一些。建议用24孔板摸索条件。siRNA所加的量及其浓度可以根据实验自己调整，按照要求配成20uM的浓度，那1ul就是20pmol,在1ml细胞培养液中加1ul,那终浓度就是20nM,加2ul就是40nM，以此类推。24孔板摸浓度后，用6孔板时把转染体系相应放大即可。实验中需要注意细胞状态要好，代数不要太大，细胞密度适中，50%左右（根据的细胞生长情况调节），铺板时要铺均匀，添加转染复合物时要小心滴加。转染时建议不要使用双抗和血清，双抗转染时对细胞有毒性，会导致细胞状态不好，血清会降低转染效率。2、转染试剂：转染实验前应根据实验要求和细胞特性选择适合的转染试剂。每种转染试剂都会提供一些已经成功转染的细胞株列表和文献，通过这些资料可选择最适合实验设计的转染试剂。可能细胞对lipo2000不是太敏感，如果是这样，建议更换其他的转染试剂。3、细胞原因：a、转染效率跟细胞状态、细胞代数、细胞密度等有关，一般低的细胞代数（<50）能确保基因型不变。最适合转染的细胞是经过几次传代后达到指数生长期的细胞，细胞生长旺盛，最容易转染。细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化。这会导致和转染相关的细胞行为的变化。也就是说同一种系的细胞株，在各实验室不同培养条件下，其生物学性状发生不同程度的改变，导致其转染特性也发生变化。因此，如果发现转染效率降低，可以试着转染新鲜培养的细胞以恢复最佳结果。b、有的细胞不太好转染，比如悬浮、干细胞、原代细胞等，可查找相关文献，看别人做这种细胞时用的什么方式。如果细胞不好转，就要考虑换一种方式进行您的实验了，比如说用病毒、电转等。
下图是转染FAM标记的siRNA后的前列腺癌细胞所拍的图片，转染进去的整个细胞是绿色的，可以清晰的看到细胞形态，没有转染进去的就是绿色的小点儿。  如果通过上边的问题验证到siRNA的确是可以转染进细胞，但干扰效果又不理想的话那么可能的原因如下：1、转染效率问题。如果少量siRNA进入细胞，作用于基因后，有时候细胞会有补偿机制，表达量反而升高。建议在实验前，先检测一下转染效率，观察一下，转染进去的整个细胞是绿的，没有转染进去的是一些绿色的小点粘附在细胞上，发的光是点状的。建议多做几个转染梯度，找到最佳转染条件。2、检测时间点。建议转染后24-48小时检测RNA水平变化，48-72小时检测蛋白水平变化。不同基因的半衰期是不同的，siRNA干扰是抛物线形的，多做几个时间点有利于siRNA干扰效果的测定。3、推荐RT-PCR的引物应该设计在target位置的两侧，而不是同侧。目前已经知道的siRNA介导的基因knockdown机制是RSIC先介导靶mRNA的切割，切割导致靶mRNA的降解，由于切割和降解可能具有不同的时间点，因此，设计于同侧的PCR引物可能导致假阴性结果或knockdown效率的低估。4、RNA降解。建议-20保存，溶解后要最小量分装，-20或者-80保存，3个月内用完，避免反复冻融或者4度保存。干粉保存最长最好不要超过6个月。
5、基因问题。有的基因受细胞转录后调控，mRNA能敲除，但是蛋白水平敲除不下来的，如果这样，建议换一种细胞看看。
6、干扰靶点不合适。需重新设计siRNA。 |
