关于样本前准备
01、请问一下膜蛋白的细胞免疫荧光实验有哪些注意事项呢？
与常规胞浆蛋白相比，膜蛋白先需要确定与抗体识别区域是胞内还是胞外，如果是胞外，就不需要破膜打孔，如果是胞内，则需要破膜。
02、骨组织在包埋前需要长期保存的话，储存条件是什么？
先脱钙脱水固定后再用缓冲液4℃保存，或是脱钙后直接冰冻包埋-80℃冷冻。
关于固定与切片
03、免疫荧光的固定是否必须？
必须固定。
04、组织固定的时候可以用多聚甲醛和福尔马林怎么选择？
两者都可以使用。福尔马林一般为40%浓度的甲醛水溶液，固定时使用10%的福尔马林溶液。常见的多聚甲醛溶液也是配制成4%的溶液。
05、我用新鲜组织块切片后用4%PFA固定10min，样本的核总是弥散的，为什么？
如果是做石蜡切片，样本厚度过大，10min固定时间是不够的。如果是冰冻切片固定10min应该是可以的，可以考虑样本是不是及时低温保存。
06、新鲜组织切片该怎么固定？什么条件？
一般2mm左右厚度的切片使用4%多聚甲醛固定，4℃过夜。
07、冰甲醇相对PFA固定区别是什么？
对细胞或者组织样本里的抗原蛋白结构变化不一样。
关于抗原修复
08、请问骨组织热抗原修复后脱片严重怎么处理比较好？
骨组织在修复时容易脱片确实是一个难点，可以尝试下酶修复。另外热修复可以选择稍微缓和的条件试试。比如等修复液加热沸腾后停止加热，再放入被修复组织直到恢复室温。也可以使用0.1%的多聚赖氨酸滴加覆盖整个石蜡切片然后低温烤干，再进行脱蜡脱水修复步骤。
09、抗原修复液的选择原则是什么呢？一个个尝试吗？
抗原修复液比较推荐的是两种：酸修复或碱修复，这两种各有优劣，具体情况需要多尝试摸索最优条件。经验上我们觉得 Tris-EDTA 修复能力强于柠檬酸，但使用易脱片的组织时需要小心。柠檬酸则温和一些，也能出相对干净的背景。
10、请问冰冻切片需要抗原修复吗？冰冻切片前固定还是后固定更好？
冰冻切片一般不需要做抗原修复。冷冻切片固定不是必须的，如果实验流程很长可以采用切片后再固定的方式，固定方法为4%多聚甲醛处理10min。
关于封闭
11、阻断过氧化物酶和山羊血清封闭这两步是石蜡切片做免疫组化必须么？为什么呢？
阻断过氧化物酶和山羊血清封闭这两步是否必须取决于样本，比如抗体特异性很好，染色的时候即使不做阻断过氧化物酶，它的信号染色特异性也挺好的。如果是内源性的过氧化性酶比较丰富的组织或是红细胞较多，如果不做，可能会带来一定程度上的背景。同样的如果是内源性IgG比较丰富的样本不用山羊血清封闭的话，可能会产生背景高的影响。因此，这两步还是建议要做的。
12、可不可以不封闭呢？感觉不封闭结果也没差别？
封闭不是必须的，可能还是要看抗原表达部位和抗体性能。
13、血清封闭，封闭的主要是二抗的非特异性染色吗？
是的。血清主要封闭非抗原抗体特异结合出现的假阳性，常见的如蛋白吸附于高电荷的胶原和结缔组织成分上，所以无论一抗或是二抗的蛋白都应该避免此类非特异结合的现象。
关于抗体选择
14、请问488荧光二抗有比较严重的非特异性结合吗？
先确定是否是二抗引起的非特异性结合，可以做对照，只用二抗不用一抗的染色，看是否是二抗引起的非特异性结合。如果结果是有结合的话，考虑是不是抗体浓度过高等原因。
关于显色
15、免疫组化中苏木素染核时间和DAB染色时间，如果没有显微镜的话一般怎么确定时间
Meyer苏木精染色一般是室温2min，DAB显色可以把时间控制在5min左右。一般对目的着色的组织部位和分布面积须有一定的预判，以确认是否已充分显色。
16、硫酸铜复染增强显色是什么原理？
早期DAB配方中其实是有加入金属离子来改变其沉淀的色泽，在细胞核的DAB着色中可观察到铜离子复染有增强效果。（它不会改变实验不同组着色本身的相对强弱关系，实验是平行做的用相同的方法就是可信的）。
17、硫酸铜复染后做定量分析，结果还有可信度吗？
一般不影响，做好对照就可以。
关于结果分析
18、DAPI染核的时候，有的时候核只染成了一圈蓝色，没有染出完整的蓝色的核是什么原因呢？
可能是细胞没有完全固定。
19、AP和底物显色很浅是什么原因？
可能是抗体浓度的原因，尝试换一个二抗。
20、我有一个抗体，染色后阳性结果较多，能用二抗来源血清封闭来改善吗？
如果是非特异的着色较多，可考虑提高一抗稀释比，同时使用血清封闭，看是否有改善。牛血清或山血清都可试用。
21、IHC返蓝有什么注意事项吗？最好用酒精氨水还是水冲洗就可以了？
偏碱性的缓冲液就可以了，目测有红变蓝，时间一般不超过10min。否则考虑苏木精是否自氧化过度。
22、做IF时细胞质和核都染上色了是什么原因？
首选判断一抗是否在细胞质和细胞核都会着色，如果不是可切换细胞的固定方式，如果有背景，按照降低背景的处理方式进行实验。
23、做免疫荧光的时候，背景里有小的荧光杂点，怎么解决？
做阳性对照实验，确定荧光杂点来源，如果是一抗来源，减少一抗使用浓度，减少孵育时间，增加洗涤次数，抗体洗涤液加入0.1%Tween；如果是二抗来源，使用滤器过滤二抗工作液。
24、细胞接种在材料上，材料吸附染料怎么办？
换不吸附染料的材料接种细胞，如果一定要用这种材料，可选择多种荧光染料做预实验，筛选出不被染料吸附的材料。
25、组织自带荧光咋办？
选用长波长的荧光二抗，比如647荧光素，或者使用商品化的自发荧光消除试剂。在往期推文详细介绍咯！
26、用Strepavidin染biotin有很多背景杂点该怎么解决？
考虑延长Strepavidin封闭时间，实在不行建议换用两步法。
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