免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的一项技术。

IHC的实验流程和方法总体不难，但做出漂亮的染色结果却不容易，所谓“细节决定成败”，也正是IHC实验中尤为重要的关键点。

那么“细节”主要是哪一些呢？下面就由Proteintech公司免疫组化部门资深实验员为您一一道来。（以石蜡组织切片为例介绍）

1)标本固定

固定的目的除了使细胞内的蛋白质凝固，减少或终止内源性或外源性细胞内分解酶的反应，防止组织细胞自溶，更是为了保存组织或细胞内的抗原性，使抗原不失活，不发生弥散。不同的抗原对固定液耐受程度不同，因而要选择合适的固定剂。

现在常用的固定剂有中性甲醛液，4%多聚甲醛-磷酸盐缓冲液。有些固定剂对特殊组织有更好效果，如苦味酸对于头皮、指甲固定有软化效果，Helly固定液对于胰岛和垂体效果较好，PLP固定液对于含糖组织抗原保存更好。

2)脱水、石蜡包埋和制片

脱水用梯度乙醇(由低到高)充分脱水，对于一些易脆的组织（如肝、脾等）应减少高浓度酒精里的停留时间，透明的时间也应该控制缩短。

对组织浸蜡时，一般选用56℃~58℃熔点的石蜡，浸蜡温度最好不超过60℃，防止抗原的损失。

包埋时应选好角度动作迅速，以便切片时有完整的切面。切片时则要该快则快该慢则慢，及时检查刀片是否出现缺口，防止蜡带出现划痕。

3)脱蜡和水化

使组织恢复到固定后的正常状态暴露出抗原以方便与一抗结合。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。

4)抗原修复

由于组织在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而掩盖抗原决定簇。通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。

常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压加热修复、微波修复、胰酶修复。其中高压加热修复这一方法简便易操作，效果也更好。

使用高压加热修复对于修复温度和时间的把握十分重要，温度越高修复时间越短，温度与修复时间呈负相关。修复结束后注意室温冷却，让蛋白自然复性。其次，尽量使用过量的抗原修复液，防止高温液体挥发干涸，对切片造成不可逆的损伤。

同时不同pH值修复液对修复结果的也有不同影响。如下图所示不同修复液对比的结果，所以如何选择修复液还因该酌情而定，不能一成不变。

△60347-1-Ig（CD3G antibody）用柠檬酸修复后细胞膜的着色明显比Tris-EDTA修复和未修复的着色多（左图未进行抗原修复，中间图使用Tris-EDTA修复，右图使用柠檬酸液修复）

5)灭活内源性过氧化物酶和生物素

在传统的ABC法和SP法中，免疫组化反应容易受到内源性过氧化物酶和生物素的干扰，必须用过氧化氢和卵白素等进行灭活和封闭。

灭活内源性过氧化物酶一般用3%过氧化氢灭活约10 min左右，用甲醇配制过氧化氢更适合于保护抗原和固定组织。

6)血清封闭

为了防止一抗与组织的非特异性结合，造成假阳性，一般会采用BSA、羊血清等封闭这些位点，封闭血清一般是和二抗同一动物来源的，室温封闭10-30 min。

7)一抗和二抗浓度和孵育时间

不同的一抗浓度，孵育时间和温度等对染色结果往往有着较大的影响。在4℃下，反应缓慢，背景较浅；而37℃反应较快，时间较短；室温介于前两者之间，选择室温孵育有助于实验流程的便利，同时也适用于较多样本的检测。二抗一般室温孵育30 min。

8)切片清洗(浸洗、冲洗和漂洗)

为了防止一抗、二抗等残留而引起非特异性染色，适当地加强清洗尤其重要，建议使用洗瓶冲洗 30s X 3 次，而一抗孵育后可用TBST单独清洗。清洗中要注意单独冲洗，防止交叉反应造成污染，同时温和冲洗，防止脱片。TBS的pH和离子浓度建议用为7.6-8.0，浓度是0.01 M。中性及弱硷性条件有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解。

9)DAB显色

背景的深浅和特异性染色的深浅都可以由DAB孵育条件决定。DAB显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现特异性染色较强而背景着色较浅时即可冲洗。

DAB显色时间很短(如几秒或几十秒)就出现很深的棕褐色，这很可能说明一抗浓度过高，需要下调抗体浓度；若很短时间就出现深背景，有可能非特异性蛋白封闭不全，需要延长封闭时间；DAB显色时间很长(如超过十分钟)才出现阳性染色，可能是一抗体浓度过低或者封闭时间过长。

对于较弱的DAB颜色有时可以采取增强方法。如加入金属离子：硫酸铜、六亚甲基胺银、氯化钴、硫酸镍铵、氯化镍及咪唑等。下图就是DAB显色后浸泡硫酸铜溶液后的结果。

△66340-1-Ig （Bcl 6 antibody）使用常规DAB染色颜色较浅（左图），而继续使用硫酸铜处理颜色就较深（右图）。

10)复染

免疫组化染色后必须进行复染，以衬托出组织形态结构。目前常用Mayer's苏木素复染，一般2 min分钟左右，DAB在核蛋白着色则可适当缩短复染时间，然后氨水或 pH 8.0的TBS返蓝。

11)封片

为了持久保存，通常会使用中性树胶等封片。封片过程中注意斜靠盖玻片防止气泡产生影响观察。如果树胶较粘稠可以加入适量二甲苯稀释，使树胶在封片中能够快速扩散开。在脱水过后建议采取湿封，即组织上还残留二甲苯时进行封片，同时注意在通风厨中操作。这样有助于气泡排除干净，不影响后续镜检。

想要做出完美的免疫组化实验，除了拼装（ren）备（pin），更要靠细节！