关于/磷酸化蛋白样品，裂解液问题

蛋白的磷酸化是一个非常迅速的反应，所以取样品的过程要迅速，样品要新鲜，样品处理最好在冰上操作，操作时间尽量短。用PBS洗涤细胞时，PBS一定要4℃预冷。如果是组织的话，提取蛋白时采用液氮研磨的方法，研磨器具最好提前预冷，保持低温的状态。

提取磷酸化蛋白的裂解液最好是新鲜配制，裂解液中一定要有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，否则即使条带压出来也会很浅，结果也不可信。okadaic acid，NaF是磷酸酶抑制剂。再者，还要看你检测的蛋白磷酸化位点是什么氨基酸，如果是酪氨酸还要加1 u M的sodium vanidate即原钒酸钠，上样前不要煮沸，煮沸可能会破坏其磷酸化位点。

提取的磷酸化蛋白一定要妥善保存，最好是收集完成后马上变性并于-80℃分装保存，以保证降解程度最小。同时避免反复冻溶导致磷酸基团的降解。

关于/Western Blot操作问题

磷酸化蛋白的表达丰度较低，一般只有总蛋白量的10%，甚至更低，一定要确保每个凝胶孔中有足够的目的蛋白上样量。

磷酸化蛋白容易脱磷酸化，除提取蛋白时要迅速小心外，也可在上样缓冲液和转移缓冲液中加入磷酸化酶抑制剂Na3VO4等。

磷酸化抗体的好坏是一个关键因素，所以要选择好的厂商。好抗体，傻瓜也能做出来，不好的抗体神仙也无办法。有些公司的抗体很好，有些公司的抗体很差（一些大公司同样会有低劣产品），而且这一点对非磷酸化的抗原检测也很重要。

因为磷酸化蛋白只占总蛋白量的极少部分，加入一抗后最好4℃过夜，保证抗体有充分的结合时间。4℃也可以使一抗重复使用多次。毕竟磷酸化抗体都挺贵的。二抗则室温1h即可。4℃过夜，主要原因不是使抗体结合更好，而是蛋白抗原不容易从膜上脱落。蛋白抗原在膜上靠的是物理吸附属热力学范畴，高温下容易脱落。而抗体-抗原结合是热力学与动力学问题，高温容易结合是热力学范畴，抗体、抗原浓度却是动力学范畴。膜上的抗原脱落了，结合效率会低。

磷酸化蛋白WB时，用洗涤液漂洗时也要注意一下，摇床的转速不要太快，洗的时间不要太长，孵育一抗和二抗之后分别洗3次，每次5min即可。宁愿深一些，总比做不出来强得多。另外，洗的时候，最好不要把几张膜叠在一起洗。

关于/磷酸化抗体的说明书

磷酸化抗体的说明书大家一定要仔细看，并最好根据厂商的操作说明来操作实验，这是实验成功的保证。因为不同的磷酸化抗体公司推荐的操作步骤不同。比如upstate的gamma-H2AX就需要脱脂奶粉封闭，一抗、二抗也需要脱脂奶粉配制；而CST的一些抗体则是脱脂奶粉封闭，一抗、二抗用BSA配制。其中原因不详，但是应该是非常关键的，我试过用BSA配gamma-H2AX，背景很高，目的条带非常淡。

关于/WB时背景和条带的问题

磷酸化蛋白WB时背景也往往较深，所以压片时间要适当，不能太长或过短，太长则背景太深盖住想要的那条带，时间过短则可能没有条带或者条带太浅。

洗涤液对最后的背景影响也较大，密理博（millipore）最近的说明书推荐用双蒸水洗涤，我对比了TBST洗涤的膜，效果有一定差距，背景有效降低，即便压片30min，背景仍然是可以忽略的。我想，双蒸水充分减少了ECL反映中其他缓冲液的影响，应该是可取的。

做磷酸化蛋白WB时，除了目标蛋白的条带以外，往往会出现非特异性的条带。磷酸化抗体不好的话，甚至会压出非特异性的条带，反而没有你想要的条带，所以压片后，一定要根据Markers比对一下你压出的条带分子量是否正确。

关于/蛋白总的表达量问题

研究完某一蛋白的磷酸化情况后最好也要研究一下该蛋白总的表达量。这有两种方法，一是：相同的样品在不同的孔中上样两次（可在相同的胶上，也可在不同的胶上），其一压磷酸化蛋白，另一压该蛋白总的表达量（包括磷酸化和未磷酸化的该蛋白），甚至还可跑另一个胶，压内标。但是一般不建议如此做，因为这样比较时误差还是较大的。因此，比较公认的，也是常用的方法，即用strip液将原先结合上的磷酸化抗体及二抗洗去，然后用同一张膜压总蛋白。然后再洗脱一次，再压内标。

关于/Strip时的问题

Strip时一定要注意，膜一定要完全泡在strip solution中（可用较硬的塑料膜封好），然后要完全浸入水中，使受热均匀。这一点很重要，要不然，随后压出来的总蛋白也好，内标也好就会不均一，无法进行比较。

strip液是用来去除已结合的抗体，但也会去除部分的蛋白，导致蛋白信号变弱。实验发现水浴有时温度不稳定，温度定为55℃时往往其温度容易超过，导致较多的蛋白也被去除，故建议温度设为50℃，30min，既能有效去除已结合的抗体，又比55℃更能保护蛋白。