流式细胞仪检测分析的对象是细胞或者细胞样颗粒性物质，所以流式细胞术是细胞学的重要研究手段之一。而如何准备合格的样品是包装实验数据准确的基础，下面就讲一下如何制备流式样品。

独立细胞样品制备

如果研究对象是体外培养的悬浮细胞，则直接收集细胞于离心管中，离心沉淀细胞，然后用PBS重悬沉淀，取适量细胞于离心管中，标记相应的荧光素偶联抗体，最后洗去未结合的抗体，用流式PBS重悬细胞于流式管中，则可上样分析样品细胞。如果该培养细胞是贴壁细胞，需用胰酶消化细胞适当时间后，用移液器反复吹打，收集待测样品细胞，离心后标记荧光素偶联抗体即可。

如果研究对象是外周血，根据目标细胞的不同可以有两种处理方法。如果研究对象是外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclearcl，PBMC），最常用的提取方法是Ficoll-hypague密度梯度离心法Ficoll-hypague密度梯度离心法分离PBMC：

（1）抽取适量的血液于离心管中，该离心管必须事先加上抗凝剂，防止血液凝固。

（2）用PBS稀释血液，稀释倍数可以根据血液的浓稠度加以调整，一般以2-4倍为宜。

（3）根据稀释后血液的总量选用15ml离心管或者50ml离心管，先加入离心管1/4左右体积的Ficoll分离液，然后慢慢将稀释后的血液小心叠加到Ficoll分离液的上层，体积是 Ficoll液体积的2.5-3倍为宜。注意叠加血液时一定要轻柔，避免加入的血液与Ficoll液相混合，这一步很关键，如果血液层与Ficoll液层互相混合，就无法成功分离PBMC。

（4）将离心管在水平离心机中离心，中速离心30min。

（5）取出离心管，此时离心管内的液体分为三层，如图所示，上层为血浆，中层为含有PBMC的 Ficoll液，最下层为红细胞，注意此时要轻拿轻放，切勿将分层的液体重新混合。PBMC主要位于 Ficoll液的上层，即血浆层与 Ficoll液层的交界处，肉眼见到的混浊絮状物就是PBMC，用吸管小心吸取中层的 Ficoll液，尽量吸尽其中的混浊絮状物，吸入少量血浆不会影响结果，但需避免吸入最下层的红细胞。

（6）将得到的含有PBMC的中层Ficoll分离液置于新的离心管中用PBS稀释，至少稀释一倍。此PBS稀释步骤必不可少，如果不经PBS稀释直接离心，则离心时无法有效沉淀PBMC，因为PBMC密度小于Ficoll，不稀释直接离心时PBMC仍将位于Ficoll分离液上层。

（7）低速离心10min，使PBMC沉淀，而血小板悬浮于上层液体中弃去含有血小板的上层液体。如果血小板去除不满意，可以重复低速离心一次。

（8）用PBS重悬PBMC沉淀，中速离心5min，沉淀即为PBMC。

如果研究对象是包括多核粒细胞的外周血白细胞，就不能用Ficoll-hypaguea密度梯度离心法，因为该法会同时去除多核粒细胞和红细胞。这时可以采取直接用红细胞裂解液裂解红细胞的方法，然后多次低速离心去除红细胞碎片即可。

收集人的外周血方法比较简单，直接静脉采血，收集于抗凝管中即可。

收集小鼠的外周血最常用的方法是眼眶取血法：常规麻醉小鼠用弯镊钳住小鼠的一侧眼球，轻轻将眼球连同眼球后的血管一起拉出，用力摘除眼球，倒置小鼠，将眼眶部位对准收集管，血液会自动从小鼠眼眶部位流出，流速慢时可以适当挤压小鼠心脏部位。

如果研究对象是胸水、腹水、脑脊液等体液内的细胞，只需直接将体液标本离心，弃上清，用PBS重悬沉淀，就可以标记荧光素偶联抗体然后进行流式上样分析。

免疫器官样品制备

免疫器官包括中枢免疫器官和外周免疫器官，中枢免疫器官是免疫细胞发育的场所，主要包括骨髓和胸腺，外周免疫器官是免疫细胞发挥功能的场所，主要包括脾脏和淋巴结。免疫器官主要由免疫细胞组成，免疫细胞之间基本是相互独立的，很少形成稳定的连接，而且免疫器官内结缔组织含量也比较少，所以将免疫器官制备成单细胞悬液相比于其他实体脏器要容易得多。

研究小鼠的骨髓细胞一般提取长骨如股骨和胫骨内的骨髓。

骨髓单细胞悬液制备方法：

（1）颈椎脱臼处死小鼠，用剪刀、镊子直接分离小鼠的股骨和胫骨。

（2）用1ml的注射器在股骨或胫骨的两端钻孔，然后用该注射器吸取培养基，反复冲洗股骨和胫骨的骨髓腔，将骨髓腔内的细胞冲洗出来。

（3）用枪头或者移液管反复吹打冲洗液中的骨髓细胞，使骨髓细胞尽可能相互分离，成为单细胞悬液。

（4）离心沉淀骨髓单细胞悬液，红细胞裂解液裂解红细胞。

（5）离心弃上清，去除红细胞碎片。

（6）用PBS重悬沉淀，就可以进行后续荧光素偶联抗体标记，然后进行流式上样分析。

胸腺、脾脏和淋巴结内主要是相对独立的免疫细胞，制备这些脏器的单细胞悬液，只需直接将脏器经钢网研磨即可。

胸腺、脾脏和淋巴结单细胞悬液制备方法：

（1）颈椎脱臼处死小鼠，分离需要制备单细胞悬液的脏器。

（2）取一干净平皿，放入钢网，将脏器置于钢网上，加入适量PBS或者培养基。用硏磨棒轻轻硏磨脏器，尽量将所有脏器组织研磨成单细胞状态，直到只剩下脏器的结缔组织为止。注意研磨时动作应轻柔，用力过大可导致细胞死亡。

（3）弃去钢网和钢网上的结缔组织，收集平皿内的细胞悬液，离心沉淀。

（4）红细胞裂解液裂解红细胞，离心去除红细胞碎片。

（5）用PBS重悬沉淀，就可以标记荧光素偶联抗体，然后进行流式上样分析。

实体脏器样品制备

实体脏器如肺脏、肝脏和胂瘤组织内含有较多的结缔组织，实体脏器细胞之间一般结合紧密，所以直接研磨脏器法无法得到理想的单细胞悬液。因此，研磨前需将脏器剪碎后加入Ⅳ型胶原酶消化，消化后的组织再用研磨棒直接硏磨，以后的步骤与免疫器官样品制备相同。

Ⅳ型胶原酶消化脏器的最佳时间各不相同：肝脏组织较脆，结缔组织含量相对较少，一般消化0.5-1h；肺脏组织较韧，完全消化大约需3h；肿瘤组织根据组织类型的不同而异，一般需1-2h实体脏器硏磨后的单细胞悬液以实体细胞为主，如果研究目标不是实体细胞，而是脏器内浸润的免疫细胞，可以用Percoll密度梯度离心法富集免疫细胞，然后再进行流式分析。

在制备单细胞悬液的过程中，尤其是在制备粘连性较大的实体脏器的单细胞悬液的过程中，如人的肿瘤组织等，经常会在缓冲液中加入EDTA等阳离子螯合剂以防止单细胞再聚集。EDTA等在防止单细胞再聚集方面有较好的作用，但它可能会影响实验结果，如EDTA会螯合缓冲液中的钙离子，大幅度减弱荧光素偶联的抗人CD8单抗的荧光信号，若同时加入CaCl2可有助于抵消EDTA对抗体荧光信号的影响。因此，研究者应该严格比较加入EDTA组与不加EDTA组的实验结果，排除EDTA对实验结果的影响。