这篇并不是纯讲信号通路的文章，而是一篇讲circ-RNA的文献：

不用查了，就是上次从7分上10分的那本Molecular Cancer……这次的主角是AKT的circRNA，因为他们是一步步做出来的，所以夏老师会讲得慢一点，今天估计是讲不完的，机制研究部分就下次再讲了。

首先他们通过RNase-R富集，通过测序，获得了差异的circ-RNA：

就二代测序这一步就已经差不多宽油劝退了，还要RNase-R富集，原理差不多是这样的：

RNase-R是一种会消化线性RNA的RNA酶，所以经过RNase-R处理后，样本中就只剩下环状的RNA了。

接着自然是进行PCR之类的验证，circRNA的引物只能在环状交接处设计，这样才能只扩增出环状RNA，而线性的无法扩增出产物：

当然，为了进行验证，还需要进行circRNA的敲减，而shRNA的位置，也必须设计在环状的交接点上，否则会误敲掉正常的线性mRNA：

对于这个circRNA的定位分析，发现她主要出现在胞质中：

这说明啥呢？说明吧，这玩意应该不会参与转录调控，调控的功能应该在转录后或者是翻译阶段。

于是他们分析了一下这个circRNA的序列，发现了上面存在的IRES序列，也就是翻译起始位点：

进而发现这个circRNA能翻译出一个较短的蛋白，为了验证这个IRES序列的翻译起始功能，他们做了双荧光的验证……

这个验证方法是差不多这样、：

由CMV启动翻译一个海参的荧光素酶（RLuc，作为内参对照），后面接上IRES接着的萤火虫荧光素酶（Luc），如果IRES能启动翻译，则两个荧光素酶都起作用，如果IRES无法启动翻译，则只有前面的RLuc会起效。以此他们发发现了这个circRNA的IRES序列有启动翻译的功能，接着还打质谱验证了这个蛋白……

然后经过分析发现，这个AKT3-174aa的蛋白表达量高的，生存曲线更好看（本身就是在肿瘤中低表达circRNA中筛选出来的），而AKT3不存在这种相应关系：

确定了一个这样的蛋白，那接下去就是做相应的功能试验了：

蓝儿，这样简单的功能试验并不能说明蛋白的问题，同时，需要排除掉是circRNA的其他功能，导致了这些表型的产生，于是他们做了这样的验证：

也就是在敲减掉circRNA的条件下，做了一个线性的AKT3-174aa的过表达载体（当然，应该会在对应位点密码子上进行简并性的突变，否则就全敲掉了）。以此确认，真正对肿瘤细胞产生功能的，是这个由circRNA翻译出来的这个短片段蛋白：