今年暑假我们实验室新来了个小师妹，刚开学，老板就把一个大项目交给她了，心中很是疑惑。早上偶然听到保安室大爷说这个小师妹可是做的一手好实验，尤其ELISA，可以说是“不可多得”的高手啊。（大爷，您这小道消息可真够灵通的！）大爷一脸害羞，“她来报到的时候问路来着，就聊了两句”。

我“ELISA小霸王”还没说话呢，就有人敢称高手。不行，今天必须要比划比划。（话说我虽然早来一年而已，ELISA实验大部分时候还是不错的，偶尔会出现阴性结果，不过至今还不知道原因，运气的成份很大。）

对，就这么办，拿这块刚出来的板子，找小师妹“请教”一下去（额，态度还是要谦虚些，共同学习一下嘛）。

师妹只看了一眼便说：“引起ELISA测定错误结果的原因主要有：①标本因素；②试剂因素；③操作因素。我这里总结了一份ELISA经验，分享给你吧！”

这里我们就一些常见ELISA操作过程中的问题进行一一分析：

1. 样品稀释

酶联免疫反应是一种敏感性很高的反应，如果血清不稀释，不可避免会产生很强的非特异性反应，出现假阳性。因此试剂盒一般会规定将血清稀释至适当的倍数，以降低非特异性反应。一般产品的样品稀释倍数均通过大量试验确定，以保证试验的灵敏度和特异性。

2. 试剂盒平衡

试剂盒中所有试剂和板条均应在试验前平衡至室温(约25℃)，一般需在室温放置20～30分钟以上。平衡时间太短会造成试剂混匀不够，样品孵育时间相对缩短，ELISA反应不够充分。冬季室温低，可将试剂盒置37℃温箱20分钟。

3. 混匀及加样

稀释前、后的样品必须充分混匀，所有试剂在加样前也须摇匀，以保证试验的均一性。加样不可太快，要避免加在孔壁上部，不可溅出或产生气泡。加样太快，无法保证微量加样的准确性和均一性。

加在孔壁上部的非包被区，易导致非特异吸附。

溅出会对邻近孔产生污染。出现气泡则反应液界面有差异。

4. 温育

温育是ELISA测定中影响测定成败最为关键的一个因素。

温育所需时间与温度成反比，即温度越高，则所需时间相对较短。最为常用的温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。不同试剂盒有不同的温育时间和温育温度的选择，随意更改温育时间或者温育温度将导致试验结果出现偏差。

5. 洗板

洗涤操作将特异结合于固相的抗原或抗体与反应温育过程中吸附的非特异成份分离开来，以保证ELISA测定的特异性。洗液尽量不要溢出孔外；加洗液后静置1分钟，甩去板孔中洗液后，一定要大力拍干；及时更换吸水纸，尤其是拍过酶标记物的吸水纸一定要弃去，否则可能影响试验结果。

6. 显色与比色

显色一定要控制时间，根据试剂盒说明操作即可。一般来说，显色时间过短，结果偏低；显色时间过长，空白增高或者非特异性显色增加。比色要注意波长的选择，选择合适的滤光片。

综上所述，尽管ELISA测定的操作步骤非常简单，但有可能会影响测定结果的因素却较多，分布在测定操作的各步之中，尤以加样、温育和洗板为甚。