不知不觉几年下来自己也快毕业了，感谢丁香园这些年来的帮助。没有什么可回报的东西，就教教新人如何设计引物吧，尽量做到手把手的教，图文并茂。

丁香园论坛中关于引物设计的帖子不少，以前很多站友会推荐 Oligo、PrimerPremier、DNA man 等等软件。这些软件设计完最后还是要去 BLAST 比对下，所以我教大家一种易懂实用的在线设计方法。

就以人的 PTEN 基因为例，首先你要找到他的基因序列，如果你要用的是 cDNA，就找它的 mRNA 序列。如果你要做的是 DNA，就找 DNA 的序列。

以 cDNA 为例，普遍的一种方法是上 Pubmed 中 GENE 栏搜索找到 cDNA 那栏，但 Pubmed 导出序列不太方便，我介绍个网站 http://asia.ensembl.org/index.html。

1. 输入目的基因，进入。

   
   

   

   
   

   
   

2. 在左侧栏选择 TRANSCRIPT，选择后进入。

   
   

   

   
   

   
   

3. 选择 PTEN-001 中的 TRANSCRIPT 进入，点击左侧 cDNA。

   
   

   

   
   

   
   

4. 然后点击 CONFIGURE THIS PAGE 进入设置你要显示的内容。

   
   

   

   
   

   
   

5. 除了第一栏 SHOWEXONS 选择 YES 外，其他的都选择 NO，然后取个名字保存 SAVE CONFIGURATION AS。

   
   

   

   
   

   
   

6. 然后在左侧栏点击 DOWNLOADVIEW AS RTF 可下载你要的 cDNA 序列，这个文件可以用 WORD 打开，不同的颜色代表一个外显子间断。

   
   

   

   
   

   
   

   下载后打开的 Word。

   
   

   

   
   

   
   

7. 然后根据可以根据你感兴趣的序列设计引物了，比如我在分别在第 6 和第 7 外显子分别设计上下游引物。选取并复制第 6 和第 7 外显子序列。

   
   

   

   
   

   
   

8. 登陆 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/，粘贴这段序列，设置好 RANGE 和 PCR 产物的大小，然后在下面点击 GET PRIMERS，可以在线设计并比对引物。

   
   

   

   
   

   
   

9. 最后选择一个比较特异性的引物，条带大小要尽量单一，其他的基因序列尽量不要比对到。