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引物用量偏大,引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。
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循环的次数过多。适当增加模板的量,减少循环次数。
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酶的用量偏高或酶的质量不好,应降低酶量或调换另一来源的酶。
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退火温度偏低,退火及延伸时间偏长。应提高退火温度,减少变性与延伸时间,也可采用二种温度的 PCR 扩增。以 2 度为梯度设计梯度 PCR 反应优化退火温度。
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样品处理不当。
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Mg2+ 浓度偏高,因适当调整 Mg2+ 使用浓度。
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若为 PCR 试剂盒,也可能时试剂盒本身质量有问题。
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复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。
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反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。
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引物特异性差。利用 BLAST 检查引物特异性或重新设计引物。
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引物量过多。减少反应体系中引物的用量。
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模板量过多。质粒 DNA 的用量应<50 ng,而基因组 DNA 则应<200 ng。
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外源 DNA 污染。确保操作的洁净。